Švábová Lenka, Ing. Ph.D.

GRIGA, Miroslav, Eva TEJKLOVÁ, Iva SMÝKALOVA, Magdalena CVEČKOVÁ, Lenka ŠVÁBOVÁ, Martina VĚTROVCOVÁ, Miroslava VRBOVÁ a Jiří HORÁČEK. Utilization of doubled-haploid technology in the breeding programmes of winter oilseed rape, flax/linseed, caraway, pea, poppy and hemp in Agritec Ltd. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant. 2018, 54, S82–S82. ISSN 1054-5476.

In an attempt to enhance the phytoextraction capacity of L. usitatissimum through overproduction of an efficient heterologous Cd-binding peptide, we engineered linseed breeding line AGT 917 to constitutively express genetic fusion of α-domain of mammalian metallothionein 1a (αMT1a) and β-glucuronidase gus gene under the control of CaMV 35S promoter. An improved transformation protocol was developed. When tested in soils amended with Cd at 20 and 360 mg kg-1, the mature αMT1a::gus plants accumulated more Cd than parental AGT 917: the stem Cd concentrations in the best performing αMT1/2 line were 3.3- and 1.9-fold higher, respectively. Moreover, hypocotyl explants of αMT1/2 line showed 1.7-fold higher biomass than those of AGT 917 on media containing 15 mg Cd l-1, indicating that αMT1a::gus did confer higher Cd tolerance to engineered plant. Overproduction of metal-binding peptides thus appears to be a viable strategy for the production of L. usitatissimum with improved phytoremediation capacity

Plant transformation may be defined as the sequence of delivery, integration and expression of foreign genes into the plant cells which will ultimately regenerate into a whole plant. This ability to introduce and express or inactivate specific genes in the plant genomes provides a new and powerful experimental tool for validating gene function, particularly in relation with various plant physiology mechanisms and processes that have not been resolved so far using other biochemical approaches. Another non-negligible application of this approach is that of obtaining and transferring genes that are not available to a given species due to sexual incompatibility from other plants, from microorganisms or even animals. The process involves choosing a trait, identifying and isolating the gene(s) encoding it. To be functional, such gene(s) must include the regulatory regions ensuring their correct expression in the plant. Then, a reliable protocol must be devised and followed for the transformation of genes into plants, and the DNA sequences introduced must subsequently be integrated, expressed and maintained in the genome throughout subsequent cell divisions and progenies. Finally, transformed cells must be competent for regeneration into whole plants. Gene delivery systems used to date can be divided into direct gene transfer (mediated by physical or chemical forces for delivery of the gene into plant protoplasts, cells and even tissues) and Agrobacterium-mediated gene transfer, where either A. tumefaciens or A. rhizogenes is used as vectors for introducing the foreign gene into the plant genome. In this context, recombinant DNA technology has revolutionised biotechnology in such a way that plant transgenesis is now a relatively mature approach, and plant biotechnology provides today not only novel genotypes which carry agronomically useful genes for biotic and abiotic stresses, but also others that improve plant nutrition or increase yield components.

Optimisation of two in vitro regeneration systems for low-tannine cultivars of faba bean based on culturing of shoot apices and cotyledonary nodes were provided by usage of various antioxidants - ascorbic acid, citric acid, glutathione and activated charcoal. In subsequent testing, the combined effects of antioxidants with transformation co-cultivation compounds acetosyringone and L-cysteine was studied. The application of antioxidants lead to decreased caullogenesis, citric acids treatments (50 mg.l-1) dramatically decreased necrotic response of explants. However, citric acid, used together with ascorbic acid completely inhibited shoot growth in shoot apex cultures. Glutathion evoked hyperhydricity of explants. Activated charcoal induced rooting on media which are commonly used for shoot proliferation. Combination of acetosyringone with antioxidants did not negatively influenced shoot proliferation, except of variant with ascorbic acid. Citric acid worked as the best and universal antioxidant in faba bean in vitro cultures utilizable and its use is recommended for faba bean genetic transformation experiments.

Pea somaclones of cultivars Adept, Komet and Bohatýr were obtained after selection in vitro with Fusarium solani filtrate and fusaric acid (FA). R2 regenerants were analyzed by RAPD and IRAP markers. Some markers were useful for clear discrimination between selected and non-selected variants of all studied cultivars.Flow cytometry analysis proved the same genome size of selected and non-selected pea lines. Therefore in vitro selection by pathogen derived agents could be the efficient method for obtaining pea somaclones with incrreased resistance to F. solani.

Intact plants and in vitro cultures of four pea (Pisum sativum) cultivars (Adept, Herold, Komet, Menhir) that vary in their degree of susceptibility/resistance to Fusarium solani were inoculated with this pathogen or treated with its culture filtrates to compare their reaction patterns at the phenotypic, histological and biochemical level. Changes in activity of three peroxidase forms, cytosolic, membrane- and ion-bound, and in peroxidase isozymes were studied in detail. In addition, the length and weight of roots of regenerating plantlets in explant cultures as well as symptom expression in intact plants were assessed. In planta, screening of the four pea cultivars revealed the highest degree of resistance in cv. Adept, and the highest level of susceptibility in cv. Menhir both to F. solani and its metabolites. Regarding in vitro cultures, the microfiltrated filtrates had stronger inhibitive effect than the autoclaved ones. In terms of peroxidase activity, the only significant difference among cultivars was found in its ionic form, for the most resistant cv. Adept versus the most sensitive cv. Menhir. Minor changes in activity of cytosolic peroxidase were noted in planta and in vitro, while the membrane- and ion-bound peroxidase significantly decreased in explants. The aim of our study was to compare reaction of pea plants and explants and to verify whether the application of fungal filtrates is able to mimic the F. solani pathogenesis. Several responses of explants to filtrates were found to be analogous to the plant reaction to pathogen infection both at morphological and physiological levels. These can be utilized in an early in vitro screening for plant tissue resistance to F. solani.

Set of Czech pea cultivars was transformed by Agrobacterium-mediated transformation with construct containing protease inhibitor transgene gmSPI2, originated from salivary glands of Galleria mellonela. It was exprimed in Pichia pastoris and its high effectiveness to bacterial and fungal proteases was proved.T0 plants were histochemically tested for GUS expression, then, putative transformants were tested using PCR. From total ca 300 regenerated T1 lines, 150 samples of putative transformants were tested by PCR and more than 60 of them gave positive results. In total, the effectiveness of transformation ranged between 1-5% from initially established explants. Improved resistance to insects (Bruchus pisorum) and possibly also to some fungal pathogens (complex of leaf anthracnoses and root diseases) are expected.

Výsledkem experimentů s genetickými modifikacemi hrachu za pomoci konstruktů na bázi fragmentů obalového proteinu virů výrůstkové mozaiky (Pea Enation Mosaic Virus – PEMV) a svinování listů hrachu (Pisum Seed-borne Mosaic Virus - PSbMV) byly linie hrachu se zvýšenou odolností k virovým patogenům. Přítomnost transgenů byla testována histologickým barvením genu GUS, molekulárními testy, odolnost linií byla ověřena v biologických skleníkových testech po mechanické inokulaci. Byly vyvinuty i další GM linie hrachu s transgeny získanými z genomu hmyzu, které by se měly vyznačovat odolností k hmyzím škůdcům a houbovým patogenům. Jejich genotypové vlastnosti a dědičnost transgenů jsou sledovány molekulárními metodami, fenotypové vlastnosti a odolnost bude postupně sledována ve skleníkových i polních testech v rámci výzkumných projektů ve firmě Agritec.

Pea Enation Mosaic Virus (PEMV) and Pea Seed-borne Mosaic Virus (PSbMV) represent very important economical risks for pea growers by 10-25% decrease of seed yield. In our study, the induction of virus resistance / tolerance in transgenic pea lines were developed by the introgression of full length as well as fragments of cDNA of the PEMV and PSbMV viral coat proteins which were cloned in sense and antisense orientations into pGreenII plasmid (John Innes Centre, Norwich, UK). The level of virus replication after mechanical inoculation was monitored by time-sequenced DAS-ELISA. In transgenic pea lines T3 with PSbMV coat protein fragments the concentration of virus RNA was after 14 days transiently enhanced (in average up to 125%), but after 28 days the mean of RNA concentration was 37% as compared to the control non-transgenic inoculated plants (100%).

Byly vytvořeny protokoly agrobakteriální transformace hrachu, které využívají klasickou tkáňovou kulturu (regeneraci mnohonásobných prýtů z děložních segmentů a somatickou embryogenezi z apikálních meristémů) a systém bez využití tkáňových kultur (regenerace rostlin z upravených semen). Transgeny byly stabilně děděny v generacích T1-T3. Všechny transgenní rostliny byly morfologicky normální a fertilní.

V projektu je studována reakce českých odrůd (Adept, Herold, Komet and Menhir) na inokulaci Fusarium solani a na ošetření filtráty upravenými autoklávováním a mikrofiltrací na úrovni intaktních rostlin a v kulturách in vitro. Cílem race je srovnání reakce in vitro a in planta a nalezení nejvhodnější varianty filtrate patogena pro selekce in vitro.

Pro zvýšení procenta transformovaných pletiv na explantátech po kokultivaci s Agrobacteriem byl sledován vliv odstranění epidermis z hypokotylu, vliv různé doby kokultivace a různých koncentrací acetosyringonu. Efektivita transformace byla porovnávána na základě GUS zabarvení explantátů po 3 týdnech od kokultivace pomocí obrazové analýzy. Na základě statistického hodnocení výsledků obrazové analýzy byla vyhodnocena jako neefektivnější koncentrace 100mg/l acetosyringonu a doba trvání kokultivace 10 minut. Odstranění epidermis zvýšilo procento transformovaných pletiv o 11,75 %.

Podrobný genotypově nezávislý metodický postup agrobakteriální transformace hrachu s uplatněním pro laboratoře zabývající se genetickými transformacemi luskovin, pro výuku studentů v oboru biotechnologií, pro tvorbu šlechtitelských linií hrachu s vlastnostmi nedosažitelnými klasickými hybridizačními postupy.

Pro transformace hrachu byl vytvořen nový konstrukt s fúzním proteinem SPI2:GFP tak, aby byla možná nedestruktivní detekce transformovaných tkání a studium lokalizace v buňce. Vstupní kazeta pUCA7-TX s genem gmspi2 – proteázovým inhibitorem izolovaným z hedvábí fúzovaným sekvencí GFP (green fluorescent protein) pod promotorem 35S (triple X) a OCS terminátorem.

Kombinace biolistické a agrobakteriální metody transformace umožňuje využít výhody obou transformačních systémů (přímého i nepřímého) pro různé rostlinné druhy. Termín agrolistika označuje metodu, která využívá biolistiku pro mechanické narušení explantátů a následnou kokultivaci v agrobakteriální suspenzi. Byl odzkoušen vliv acetosyringonu a L-cysteinu s cílem zvýšit efektivitu transformace.

Byl studován vliv chemických přídavných látek (acetosyringone,AS; L-cysteine, CYS; dithiothreitol, DTT; glutathione, GSH; cellulase, CEL; pectinase, PEC) a světelného režimu (16/8 den / noc, 16L/8D; stálé osvětlení, 24L; stálé zatemnění, 24D) během kokultivační periody explantátů hrachu s Agrobacterium tumefaciens na efektivitu transformace. Optimální podmínky byly stanoveny při 48h kokultivaci za 20+/-2 °C, 50 mg l-1 CYS, 100 µM AS, 16L/8D fotoperiodě.

Metoda biolistické transformace byla aplikována u hrachu a lnu. Cílem bylo optimalizovat podmínky nastavení parametrů přístroje BiolisticPDS-1000/He pro kultury in vitro u zájmových rostlinných druhů a vypracovat rutinní pracovní protokol. U hrachu byla současně porovnána účinnosti biolistiky a agrolistiky, u lnu byly odzkoušeny tři různé plasmidy s cílem optimalizovat specifické nastavení přístroje pro kultury lnu. Pro hrách bylo optimální nastavení tlak 1350 psí, FD15, L2, pro len 1100 psí, FD 15, L2. Agrolistika byla ve srovnání s biolistikou účinnější, po 23 dnech hodnocení GUS+ explantátů 16,5%, resp. 3,5%.

Dva druhy plasmidů obsahující (1) celou sekvenci obalového proteinu viru cpPEMV nebo (2) fragmenty cpPEMV a cpPSbMV byly klonovány do pGreenII plasmidu a inzertovány do hypervirulentního kmene Agrobacterium tumefaciens EHA 105 spolu s pomocným plasmidem pSoup. Transformace rostlin hrachu byla provedena podle rutinního protokolu a potomstvo prokazatelně transgenních rostlin bylo analyzováno molekulárními metodami a biologickými testy. Úroveň tolerance / rezistence transgenních rostlin byla hodnocena po mechanické inokulaci PEMV, resp. PSbMV transgenních rostlin ve srovnání s kontrolami. Úroveň replikace viru byla hodnocena postupně časovanou DAS-ELISA. Exprese transgenů a úroveň replikace viru v transgenních rostlinách byla analyzována real-time PCR.

V průběhu agrobakteriální transformace je kokultivace klíčovým krokem. Odrůdy polního hrachu Adept, Komet a Menhir byly použity v řadě experimentů s aplikací kokultivačních látek – acetosyringonu, L-cysteinu, dithiothreitolu, glutathionu, maceračních enzymů – celulázy a pektinázy. Byl také testován vliv režimu osvětlení – nepřetržité světlo nebo tma. Pozitivní vliv byl zaznamenán při aplikaci acetosyringonu a L-cysteinu. Glutathion neměl vliv na efektivitu transformace ani při opakování experimentů a při různých škálách koncentrací. Dithiotreitol a macerační enzymy, které byly použity každý zvlášť i v kombinaci, měly na efektivitu transformace negativní účinek. Režim nepřetržitého osvětlení měl pozitivní vliv na frekvenci explantátů s uniformní expresí GUS.

Optimalizované regenerační protokoly jsou předpokladem pro aplikaci biotechnologických metod v programech zlepšujících vlastnosti plodin, včetně selekcí in vitro. Byl zkoumán regenerační potenciál tvorby rostlin de novo prostřednictvím organogeneze a somatické embryogeneze u bobu a lupiny. U bobu bylo dosaženo stádia zakořeňujících prýtů organogenezí z nodálních segmentů, somatická embryogeneze z kalusu byla neúspěšná. U lupiny bylo dosaženo prýtů, ale bez schopnosti zakořenit. U lupiny bylo dosaženo somatické embryogeneze, ale bez dalších vývojových stadií. Mezi druhy Lupinus albus a L.angustifolius byly pozorovány rozdíly v responzivní reakci.

Přehledná přednáška o jednotlivých etapách vývoje GM luskovin od konce 80. let minulého století, ve kterých se postupně řešilo zlepšení agronomických vlastností, zlepšení vlastností důležitých pro spotřebitele a možnosti molekulárního farmingu. Nástin legislativních a politicko-obchodních překážek, trendů a strategií výzkumu v této oblasti. Podrobné informace o konkrétních výsledcích transgenoze u hrachu v rámci řešených projektů ve společnosti Agritec, s.r.o.

Na 5 lokalitách ČR by uskutečněn sběr izolátů virových patogenů PEMV a PSbMV (determinace symptomy na rostlinách a ELISA), které byly dále charakterizovány biologickými a molekulárními testy. Izoláty s nejvyšší patogenitou bly vybrány pro sekvenování a vývoj konstruktu pro transformaci hrachu. Strategie indukce rezistence byla založena na pathogen-derived resistance (PDR) a post-transkripčním urišování genů (PTGS). Komerční odrůdy byly transformovány a byly získány T1 rostliny s GUS/PCR pozitivní reakcí. Na těchto rostlinách bude dále studována reakce na virovou infekci.

Postup agrobakteriální genetické transformace vycházející ze trí ruzných regeneracních systému (indukce organogeneze z apikálních meristému, nodálních segmentu a regenerace upravených klícících semen) byl overen u 6 genotypu. Byly odzkoušeny ruzné podmínky kokultivace - vliv sonikace, vakuové infiltrace, chemických aditiv (acetosyringone, azacytidine, glutathione, dithiothreitol, L-cystein) a optimalizovány podmínky pro jednotlivé regneracní systémy. Potenciálne transgenní linie byly testovány histochemicky a analyzovány molekulárne PCR a Southern blot. Prenos transgenu byl overen do generace T3. Metodika je pripravena pro transformace konstrukty nesoucími šlechtitelsky a spotrebitelsky využitelné vlastnosti.

Byla presentována metoda transformace rostlin hrachu setého pomocí agrobakteriální transformace jednak s využitím in vitro a také in vitro protokolů. demonstrovali jsme úspěšnou transformaci s využitím pBIN19 konstruktu obsahujícím T-DNA s reporterovým genem GUS pro histochemickou detekci a selekčním markerem genu NPTII rezistence ke kanamycinu aplůikovaný na 6 genotypech hrachu. byla nalezeny optimální podmínky transformace a integrace transgenu byla prokázána pomocí PCR a Southern blotingu v regenerantech T1 a T3 generace.

Účinné regenerační systémy patří k nejdůležitějším předpokladům úspěšné genetické transformace. Obecně je většina luskovin považována za obtížně geneticky transformovatelné. V případě hrachu byly pro genetickou transformaci pomocí Agrobacteria využity tři techniky (embryogeneze, organogeneze a in vivo). Plazmid obsahoval reporterový gen uidA a selekční geny nptII nebo bar.