Přečtěte si více

Mikrosatelity nebo jednoduché sekvenční opakování (SSR) jsou velmi rozšířené kategorie repetitivních sekvencí DNA, které se používají v populační genetice a studiích mapování genetické rozmanitosti. Genetické a evoluční mechanismy z pohledu SSR nejsou zcela objasněny. Tři mikrosatelitní lokusy s různou pozicí v genomu hrachu (Pisum sativum L.), A9 aktivní lokus v LTR oblasti bohaté retrotransposony, AD270 a AF016458 se nacházející se v oblasti genu 5'. Srovnávací analýza 35 párů vzorků od sedmi odrůd vypěstovaných z jednoho semene po deset generací, odhalila jednu 4 bp mutaci v 10. generaci vzorku v AD270 lokusu odpovídající skokovému nárůstu v jedné další ATCT jednotce opakování.Odhadovaná míra mutace byla 4,76 x 10 (-3) na lokus a na generaci, s 95% intervalem spolehlivosti 1,2 x 10 (-4) až 2,7 x 10 (-2). Srovnávací položky odrůdy Bohatýr získané z různých kolekcí genových zdrojů , ukázaly intra a inter-odrůdovou variabilitu v doprovodných a opakovaných sekvencích. Rozdíly ve velikosti fragmentu a střídání sekvencí byly nalezeny i v dlouhodobém horizontu v in vitro organogenní kultuře, založené v roce 1983 svědčící o somatickém mutačním procesu. Důkaz homoplasie byl zjištěn v rámci nezávislých genotypů hrachu, která nepříznivě ovlivňuje spolehlivost genových zdrojů, ale také vysoce prošlechtěného materiálů. Závěry této studie mají důležitý význam pro studium fylogeneze rodu Pisum, určení odrůdy a postup registrace odrůd hrachu, kde míra mutace ovlivňuje genetickou rozmanitost a efektivních odhady velikosti výchozí populace.

Jsou presentovány současné možnosti genetiky a genomiky luskovin na příkladu hrachu setého. Je presentována situace luskovin v evropském a celosvětovém měřítku.

Cílem práce bylo studium potenciálu klasických proteinových markerů pro popis části genové kolekce rodu Pisum. Pro experimentální práci byl z kolekce vybrán soubor českých odrůd (celkem 165 položek). Semenné proteiny byly analyzovány metodou SDS-PAGE s následným barvením pomocí Coomasie Blue. Isoenzymy byly děleny metodou PAGE za nativních podmínek a jejich detekce byla prováděna pomocí běžných metod.

Byla studována genetická diverzita 164 položek hrachu českého a slovenského původu pomocí 12 SSR, 25 RBIP a 2 IRAP molekulárních markerů, společně s 42 morfologickými deskriptory. Získaná data byla analyzována pomocí výpočtu genetických vzdáleností a následné shlukové analýzy. Morfologická data takto rozdělila studovaný soubor na 5 až 7 shluků, zatímco molekulární pak na 6 až 7. Pro možnost integrace abou systémů byla využita Bayesiánská analýza pomocí BAPS software, jež vyústila v postupné odlišení shluků. Rozdělení souboru dle šlechtitelských period pak naznačilo existenci zůžení genetického spektra.

Byly presentovány poslední výsledky práce na analýze genetické diversity kolekce hrachu a vyhodnocení získaných morfologických a molekulárních dat pomocí klasických metod založených na analýze genetické vzdálenosti, tak i novějších pomocí Bayesovského přístupu modelování umožňující integrace obou typů dat. To umožnilo zjištění přesnější struktury hodnoceného souboru.

Metoda biolistické transformace byla aplikována u hrachu a lnu. Cílem bylo optimalizovat podmínky nastavení parametrů přístroje BiolisticPDS-1000/He pro kultury in vitro u zájmových rostlinných druhů a vypracovat rutinní pracovní protokol. U hrachu byla současně porovnána účinnosti biolistiky a agrolistiky, u lnu byly odzkoušeny tři různé plasmidy s cílem optimalizovat specifické nastavení přístroje pro kultury lnu. Pro hrách bylo optimální nastavení tlak 1350 psí, FD15, L2, pro len 1100 psí, FD 15, L2. Agrolistika byla ve srovnání s biolistikou účinnější, po 23 dnech hodnocení GUS+ explantátů 16,5%, resp. 3,5%.

Tested seed treatments (two doses of thiamethoxam, thiamethoxam + fludioxonil + metalaxyl-M; two doses of clothianidin + beta-cyfluthrin) showed high effects on pea leaf weevils (Sitona lineatus L.) which approved relatively long-lasting and sufficient protection of several bottom nodes of stipules simultaneously. The effects of foliar treatments (chlorpyrifos + cypermethrin; acetamiprid, lambda-cyhalothrin) sometimes were evident only on the node which was determined as the youngest node at the time of spraying. The effects of the compared seed and foliar treatments on the reduction of S. lineauts larvae numbers on roots were not proven as positive. It is possible to conclude that the foliar application had no real effect in this sense at all. However, positive significant effects of thiamethoxam and clothianidin + beta-cyfluthrin on root nodulation in general were recorded. Especially higher doses of the seed treatments increased overall nodulation from 43 till 363%.

Byla hodnocena reakce vybraných odrůd hrachu na soubor isolátů Fusarium solani.

Cílem práce bylo získání informací o zdraví prospěšných látkách u hrachu – rezistentní škrob, karotenoidy, v závislosti na odrůdě a ověření možnosti jejich využití v potravinářském průmyslu. Byla sledována změna kvality v procesu dozrávání- stanovení optimální technologické zralosti, obsah a stabilita barviv, vhodnost suroviny pro průmyslové zpracování - konzervování, mražení a sušení. Na druhé straně byla ověřena i míra rizik - výskyt patogenů, mykotoxinů a těžkých kovů v semenech hrachu. Nové poznatky se uplatní při cíleném šlechtění hrachu určeného pro potravinářský průmysl.

S využitím organogenní kontinuální in vitro kultury hrachu, založené před 21 lety, byla pomocí molekulárních markerů a flow-cytometrie studována genetické stabilita ve srovnání s původním osivem. Byla konstatována stabilita jak na úrovni ploidie, tak rovněž na úrovni retrotransposonových a mikrosatelitních markerů.

Výsledkem experimentů s genetickými modifikacemi hrachu za pomoci konstruktů na bázi fragmentů obalového proteinu virů výrůstkové mozaiky (Pea Enation Mosaic Virus – PEMV) a svinování listů hrachu (Pisum Seed-borne Mosaic Virus - PSbMV) byly linie hrachu se zvýšenou odolností k virovým patogenům. Přítomnost transgenů byla testována histologickým barvením genu GUS, molekulárními testy, odolnost linií byla ověřena v biologických skleníkových testech po mechanické inokulaci. Byly vyvinuty i další GM linie hrachu s transgeny získanými z genomu hmyzu, které by se měly vyznačovat odolností k hmyzím škůdcům a houbovým patogenům. Jejich genotypové vlastnosti a dědičnost transgenů jsou sledovány molekulárními metodami, fenotypové vlastnosti a odolnost bude postupně sledována ve skleníkových i polních testech v rámci výzkumných projektů ve firmě Agritec.

Byla získána data o šíření mikrosatelitních repetic v genomu rostlin čeledi Fabaceae pomocí transpozice nového Ty1-copia MARTIAN 8.5 kb long retrotransposonu. Tento byl isolován a popsaná z genomu hrachu setého, na základě analýzy 45 SSR sekvencí nesoucích TC repetici. Byla zjištěna vysoká evoluční konzerovanost především koncové LTR oblasti v rámci čeledi Fabaceae.

Postup agrobakteriální genetické transformace vycházející ze trí ruzných regeneracních systému (indukce organogeneze z apikálních meristému, nodálních segmentu a regenerace upravených klícících semen) byl overen u 6 genotypu. Byly odzkoušeny ruzné podmínky kokultivace - vliv sonikace, vakuové infiltrace, chemických aditiv (acetosyringone, azacytidine, glutathione, dithiothreitol, L-cystein) a optimalizovány podmínky pro jednotlivé regneracní systémy. Potenciálne transgenní linie byly testovány histochemicky a analyzovány molekulárne PCR a Southern blot. Prenos transgenu byl overen do generace T3. Metodika je pripravena pro transformace konstrukty nesoucími šlechtitelsky a spotrebitelsky využitelné vlastnosti.

Pro transformace hrachu byl vytvořen nový konstrukt s fúzním proteinem SPI2:GFP tak, aby byla možná nedestruktivní detekce transformovaných tkání a studium lokalizace v buňce. Vstupní kazeta pUCA7-TX s genem gmspi2 – proteázovým inhibitorem izolovaným z hedvábí fúzovaným sekvencí GFP (green fluorescent protein) pod promotorem 35S (triple X) a OCS terminátorem.

Práce se zabývala studium a dohadem spolehlivosti jednotlivých metod na souboru 25 v CR doporučených odrůd hrachu. Tyto byly popsány jednak pomocí 12 morfologických deskriptorů, tak i 2 isozamových, 10 mikrosatelitních a 2 retrotransposonových systémů. Bylo zjištěno, že především techniky založené na analýze DNA umožňují vysokou spolehlivost a přesnost, navíc pak rychlost a nezávislost na vlivu prostředí. Jako nejspolehlivější metoda z hlediska jednoduchosti provedení byla retrotransposonová v lokus specifickém formátu RBIP, následovaná analýzou mikrosatelitních lokusů. Retrotransposonová vícelokusová IRAP metoda, společně s analýzou isozymů pak umožňila vyhodnocení s menším rozlišením, ale v jediné analýze. Bylo provedeno statistické vyhodnocení a porovnání všech metod.

Při řešení ochrany hrachu před listopasy bylo prokázáno, že moření osiva insekticidními mořidly je nejvhodnější ochrana hrachu před těmito škůdci.Ověřovala se navržená metodika hodnocení požerků brouků na listech hrachu a byly také testovány různé druhy mořidel a postřiků v různých dávkách.

Ve skleníkových podmínkách inokulace bylo hodnoceno 16 genotypů hrachu s genem er-1 (E. pisi DC.) na náchylnost k druhu E. baeumleri. Na řapících a listech citlivých genotypů se hojně tvořily konidie a kleistocarpy. Jako zcela rezistentní zdroj proti E. baeumleri byl ve skleníku zjištěn pouze genotyp Tudor (Cebeco 4119). V polních pokusech bylo zařazeno 19 genotypů hrachu s genem er-1 (E. pisi DC.). Z nich měly vyšší stupeň odolnosti proti přirozené infekci E. baeumleri (Fallon, AC Melfort, Joel) pouze některé. K nejnáchylnějším genotypům v polních podmínkách patřily: Consort R, SGL 2024, SGL 1977 a Franklin. Kleistocarpy s 1–4x dichotomicky rozvětvenými vrcholky přívěsků se tvořily ve skleníkových a polních pokusech pouze u náchylných a velmi náchylných genotypů (SGL 444/2185, Consort R, SGL 2024, SGL 1977, LU 390-R2, Lifter, Highlight, Cebeco 1171 a Carneval R). Kontrolní genotypy bez genu er-1 (Komet, Adept a Gotik) byly v pokusech napadeny pouze druhem E. pisi.