Klenotičová Helena, RNDr.

Plant transformation may be defined as the sequence of delivery, integration and expression of foreign genes into the plant cells which will ultimately regenerate into a whole plant. This ability to introduce and express or inactivate specific genes in the plant genomes provides a new and powerful experimental tool for validating gene function, particularly in relation with various plant physiology mechanisms and processes that have not been resolved so far using other biochemical approaches. Another non-negligible application of this approach is that of obtaining and transferring genes that are not available to a given species due to sexual incompatibility from other plants, from microorganisms or even animals. The process involves choosing a trait, identifying and isolating the gene(s) encoding it. To be functional, such gene(s) must include the regulatory regions ensuring their correct expression in the plant. Then, a reliable protocol must be devised and followed for the transformation of genes into plants, and the DNA sequences introduced must subsequently be integrated, expressed and maintained in the genome throughout subsequent cell divisions and progenies. Finally, transformed cells must be competent for regeneration into whole plants. Gene delivery systems used to date can be divided into direct gene transfer (mediated by physical or chemical forces for delivery of the gene into plant protoplasts, cells and even tissues) and Agrobacterium-mediated gene transfer, where either A. tumefaciens or A. rhizogenes is used as vectors for introducing the foreign gene into the plant genome. In this context, recombinant DNA technology has revolutionised biotechnology in such a way that plant transgenesis is now a relatively mature approach, and plant biotechnology provides today not only novel genotypes which carry agronomically useful genes for biotic and abiotic stresses, but also others that improve plant nutrition or increase yield components.

Optimisation of two in vitro regeneration systems for low-tannine cultivars of faba bean based on culturing of shoot apices and cotyledonary nodes were provided by usage of various antioxidants - ascorbic acid, citric acid, glutathione and activated charcoal. In subsequent testing, the combined effects of antioxidants with transformation co-cultivation compounds acetosyringone and L-cysteine was studied. The application of antioxidants lead to decreased caullogenesis, citric acids treatments (50 mg.l-1) dramatically decreased necrotic response of explants. However, citric acid, used together with ascorbic acid completely inhibited shoot growth in shoot apex cultures. Glutathion evoked hyperhydricity of explants. Activated charcoal induced rooting on media which are commonly used for shoot proliferation. Combination of acetosyringone with antioxidants did not negatively influenced shoot proliferation, except of variant with ascorbic acid. Citric acid worked as the best and universal antioxidant in faba bean in vitro cultures utilizable and its use is recommended for faba bean genetic transformation experiments.

V projektu je studována reakce českých odrůd (Adept, Herold, Komet and Menhir) na inokulaci Fusarium solani a na ošetření filtráty upravenými autoklávováním a mikrofiltrací na úrovni intaktních rostlin a v kulturách in vitro. Cílem race je srovnání reakce in vitro a in planta a nalezení nejvhodnější varianty filtrate patogena pro selekce in vitro.

Byla prezentována nová data pro hodnocení genetické stability somatických embryí, embryogenních kalusů, neembryogenních kalusů a R0-regenerantů ze somatické embryogeneze ve srovnání s výchozím explantátem pomocí moderních molekulárních metod (tři odlišné DNA metody - SSR, IRAP, AFLP). Žádné profilové alternace mezi vzorky nebyly nalezeny. V případě metylačně citlivých variant byl detekován 4-8% polymorfismus.

Cílem práce bylo studium elektroforetických spekter celkových proteinů v různých fázích vývoje somatických embryí hrachu při použití jednoduchého protokolu přímé regenerace z apikálních meristémů na médiu s přídavkem auxinu. V jednotlivých fázích vývoje somatických embryí byla provedena stanovení obsahu proteinů a také analýzy jejich elektroforetických spekter metodou SDS-PAGE. Exprese proteinů v somatických embryích byla porovnána s jejich tvorbou v zygotických embryích ve vybraných vývojových stádiích.

Optimalizované regenerační protokoly jsou předpokladem pro aplikaci biotechnologických metod v programech zlepšujících vlastnosti plodin, včetně selekcí in vitro. Byl zkoumán regenerační potenciál tvorby rostlin de novo prostřednictvím organogeneze a somatické embryogeneze u bobu a lupiny. U bobu bylo dosaženo stádia zakořeňujících prýtů organogenezí z nodálních segmentů, somatická embryogeneze z kalusu byla neúspěšná. U lupiny bylo dosaženo prýtů, ale bez schopnosti zakořenit. U lupiny bylo dosaženo somatické embryogeneze, ale bez dalších vývojových stadií. Mezi druhy Lupinus albus a L.angustifolius byly pozorovány rozdíly v responzivní reakci.

Rutinní regenerační protokol pro embryogenní suspenze stále není k dispozici. Takový protokol by znamenal důležitý nástroj pro množení, výběr mutantů a biolostickou transformaci u hrachu. Zde jsou prezentována některá metodologická data ve vztahu k vývoji embryogenních suspenzí u hrachu.

Vývoj zygotických embryí hrachu je spojen s působením kyseliny abscisové a akumulací zásobních produktů (škrob, proteiny). Byl studován vztah mezi hladinami kyseliny abscisové a expresí zásobních proteinů u zygotických embryí v průběhu vývoje semene hrachu.

Vývoj embryogenních suspenzí je velmi důležitý pro další pokrok při studiu fyziologických i genetických aspektů somatické embryogeneze u Pisum sativum L. Studie ukazuje metodologická data, získaná během vývoje embryogenních suspenzí u hrachu a budoucí strategii pro ustavení embryogenní suspenze či repetitivní somatické embryogeneze v tekutých médiích.