Smýkal Petr, Ing., Ph.D.

Planta. November 2014, Volume 240, Issue 5, pp 1139–1146. First online: 03 August 2014. DOI: 10.1007/s00425-014-2136-9

In an attempt to enhance the phytoextraction capacity of L. usitatissimum through overproduction of an efficient heterologous Cd-binding peptide, we engineered linseed breeding line AGT 917 to constitutively express genetic fusion of α-domain of mammalian metallothionein 1a (αMT1a) and β-glucuronidase gus gene under the control of CaMV 35S promoter. An improved transformation protocol was developed. When tested in soils amended with Cd at 20 and 360 mg kg-1, the mature αMT1a::gus plants accumulated more Cd than parental AGT 917: the stem Cd concentrations in the best performing αMT1/2 line were 3.3- and 1.9-fold higher, respectively. Moreover, hypocotyl explants of αMT1/2 line showed 1.7-fold higher biomass than those of AGT 917 on media containing 15 mg Cd l-1, indicating that αMT1a::gus did confer higher Cd tolerance to engineered plant. Overproduction of metal-binding peptides thus appears to be a viable strategy for the production of L. usitatissimum with improved phytoremediation capacity

The distinctness of, and overlap between, pea genotypes held in several Pisum germplasm collections has been used to determine their relatedness and to test previous ideas about the genetic diversity of Pisum. Our characterisation of genetic diversity among 4,538 Pisum accessions held in 7 European Genebanks has identified sources of novel genetic variation, and both reinforces and refines previous interpretations of the overall structure of genetic diversity in Pisum. Molecular marker analysis was based upon the presence/absence of polymorphism of retrotransposon insertions scored by a high-throughput microarray and SSAP approaches. We conclude that the diversity of Pisum constitutes a broad continuum, with graded differentiation into sub-populations which display various degrees of distinctness. The most distinct genetic groups correspond to the named taxa while the cultivars and landraces of Pisum sativum can be divided into two broad types, one of which is strongly enriched for modern cultivars. The addition of germplasm sets from six European Genebanks, chosen to represent high diversity, to a single collection previously studied with these markers resulted in modest additions to the overall diversity observed, suggesting that the great majority of the total genetic diversity collected for the Pisum genus has now been described. Two interesting sources of novel genetic variation have been identified. Finally, we have proposed reference sets of core accessions with a range of sample sizes to represent Pisum diversity for the future study and exploitation by researchers and breeders.

Changes in genetic diversity of peas bred in the Czech Republic and in former Czechoslovakia since the mid-20(th) century were analysed using 38 molecular marker loci, including retrotransposons and microsatellites, differentiating a total of 84 alleles. Both marker types were comparably effective in revealing the genetic diversity, with a high correlation (r = 0.81), although the pairwise genetic distances of each marker type differed. In total, 175 accessions, selected from the Czech pea gene bank collection and representing the pea cultivars collected or bred in the country, were divided into three groups according to their date of sampling or variety registration. The first group contained 70 old cultivars and landraces collected prior to 1961. The second group contained 46 cultivars released from 1961 to 1980. The third group contained 59 cultivars released between 1981 and 2004. In spite of the decline in several diversity measures, differences in allele frequencies and even allele loss in three microsatellite loci were recorded over the 70-year period, while these differences between the groups were not statistically significant. In addition, genetic heterogeneity was detected in 29 accessions (15%). This indicates that although no genetic erosion could be observed since then, it is important to monitor the genetic diversity, furthermore it highlights the vital role of germplasm collections for the crop diversity conservation.

Mikrosatelity nebo jednoduché sekvenční opakování (SSR) jsou velmi rozšířené kategorie repetitivních sekvencí DNA, které se používají v populační genetice a studiích mapování genetické rozmanitosti. Genetické a evoluční mechanismy z pohledu SSR nejsou zcela objasněny. Tři mikrosatelitní lokusy s různou pozicí v genomu hrachu (Pisum sativum L.), A9 aktivní lokus v LTR oblasti bohaté retrotransposony, AD270 a AF016458 se nacházející se v oblasti genu 5'. Srovnávací analýza 35 párů vzorků od sedmi odrůd vypěstovaných z jednoho semene po deset generací, odhalila jednu 4 bp mutaci v 10. generaci vzorku v AD270 lokusu odpovídající skokovému nárůstu v jedné další ATCT jednotce opakování.Odhadovaná míra mutace byla 4,76 x 10 (-3) na lokus a na generaci, s 95% intervalem spolehlivosti 1,2 x 10 (-4) až 2,7 x 10 (-2). Srovnávací položky odrůdy Bohatýr získané z různých kolekcí genových zdrojů , ukázaly intra a inter-odrůdovou variabilitu v doprovodných a opakovaných sekvencích. Rozdíly ve velikosti fragmentu a střídání sekvencí byly nalezeny i v dlouhodobém horizontu v in vitro organogenní kultuře, založené v roce 1983 svědčící o somatickém mutačním procesu. Důkaz homoplasie byl zjištěn v rámci nezávislých genotypů hrachu, která nepříznivě ovlivňuje spolehlivost genových zdrojů, ale také vysoce prošlechtěného materiálů. Závěry této studie mají důležitý význam pro studium fylogeneze rodu Pisum, určení odrůdy a postup registrace odrůd hrachu, kde míra mutace ovlivňuje genetickou rozmanitost a efektivních odhady velikosti výchozí populace.

Retrotransposon segments were characterized and inter-retrotransposon amplified polymorphism (IRAP) markers developed for cultivated flax (Linum usitatissimum L.) and the Linum genus. Over 75 distinct long terminal repeat retrotransposon segments were cloned, the first set for Linum, and specific primers designed for them. IRAP was then used to evaluate genetic diversity among 708 accessions of cultivated flax. Application of Bayesian methods for clustering resulted in the robust identification of 20 clusters of accessions, which were unstratified according to origin or user type.These findings provide a basis for better flax germplasm management, core collection establishment, and exploration of diversity in breeding, as well as for exploration of the role of retrotransposons in flax genome dynamics.

We have reviewed the current status of grain legumes germplasm collections worldwide with emphasis of its utilization for crop breeding. Sections involved also the use of introgression from wild crop relatives to widen the genetic diversity.

Udržování genetické integrity kolekcí genových zdrojů je klíčovým cílem dlouhodobé ex situ konzervace. Periodicke regenerace, na malých pokusných parcelách s malým počtem rostlin, zvyšuje riziko genetického driftu a změn genetické rozmanitosti. V této studii, bylo hodnoceno šest bělokvětých odrůd polního hrachu (Pisum sativum L. subsp sativum var sativum): Bohaty'r, Klatovký Zelený , Hana'k, Moravský hrotovicky krajovy'', Raman a Viktoria -75 a čtyři odrůdy barevně kvetoucí, krmného hrachu (P. sativum subsp sativum var arvense (L.) Poiret: týden Arvika, C esky bana'n, Moravská Krajová "a Nike", což představuje československé odrůdy a krajové odrůdy , pěstované v posledních 40-80 letech. Byly analyzovány pomocí deseti mikrosatelitních lokus specifických markerů. Každá odrůda byla zastoupena 20 semeny, dvou vzorků různých období, překlenující období 20 nebo 40 let. Současně byla detekována vnitrodruhová variabilita (s výjimkou odr. Hana'k), jako důkaz genetických změn, např. rozdíly ve frekvencích alel , stejně jako genetickém složení vzorku, u šesti z deseti odrůd (Arvika, Bohaty'r, Cesky bana'n, Moravský "hrotovicky" krajovy ", Moravská To Krajová" a Raman). Důkaz genetické eroze byl nalezen ve třech odrůdách Cesky bana'n, Moravský hrotovicky krajovy "a Raman), zatímco u jiných tří (Arvika, Bohatyr a Moravská Krajová ") bylo zjištěno, že se zvýšila úroveň rozmanitosti. Navíc ve třech vzorcích Bohaty'r (2004) a Klatovský Zelený (o 1963 a 2004), byla zjištěna nízká úroveň heterozygotnosti . Tyto výsledky ukazují, že u hrachu, samosprašné a vysoce homozygotní rostliny, nebezpečí ztráty genetické integrity existuje. Tato zjištění jsou významná pro dlouhodobé ex situ vedení kolekcí.

Virus mozaiky hrachu přenosný semenem (Pea seed-borne mosaic virus, PSbMV) patří v současné době mezi nejčastěji se vyskytující virové patogeny, způsobující vážné škody na porostech hrachu setého a některých dalších zástupců luskovin. Těmto škodám lze předejít pěs-továním rezistentních odrůd. Spolehlivé markery rezistence však dosud chyběly a šlechtění bylo náročné. Byly identifikovány geny eIF4E resp. eIF4E(iso) odpovídající lokusům sbm-1 (LG VI) a sbm-2 (LG II), zprostředkující recesivně založenou rezistenci k několika virovým patogenům rodu Potyvirus, včetně PSbMV. Určili jsme alely eIF4E genu u vybraných genotypů hrachu, zahrnujících všechny dostupné a v praxi používané donory rezistence k PSbMV. Na základě sekvenční analýzy byly navrženy, testovány a vybrány PCR molekulární markery, umožňující identifikaci jak homozygotních tak heterozygotních rostlin se 100% spolehlivostí. Touto nedestruktivní analýzou je možné uskutečnit výběr vhodných jedinců v řádu několika hodin - na rozdíl od několikadenních virologických a imunologických testů.

The tribe Fabeae (formerly Vicieae) contains some of humanity’s most important grain legume crops, namely Lathyrus (grass pea/sweet pea/chickling vetches; about 160 species); Lens (lentils; 4 species); Pisum (peas; 3 species); Vicia (vetches; about 140 species); and the monotypic genus Vavilovia. Reconstructing the phylogenetic relationships within this group is essential for understanding the origin and diversification of these crops. Our study, based onmolecular data, has positioned Pisum genetically between Vicia and Lathyrus and shows it to be closely allied to Vavilovia. A study of phylogeography, using a combination of plastid and nuclear markers, suggested that wild pea spread from its centre of origin, the Middle East, eastwards to the Caucasus, Iran and Afghanistan, and westwards to the Mediterranean. To allow for direct data comparison, we utilized model-based Bayesian Analysis of Population structure (BAPS) software on 4429 Pisum accessions from three large world germplasm collec tions that include both wild and domesticated pea analyzed by retrotransposon-based markers.

Monografie shrnuje nejnovější poznatky o pěstování, šlechtění a ochraně luskovin, získané v řadě výzkumných projektů a výzkumného záměru. Je členěna do několika kapitol, v obecné části, která se zabývá botanickou charakteristikou, agrotechnikou, jakostí a využitím luskovin tak i genetikou a genomikou. Speciální část je rozdělena podle nejvýznamnějších druhů. Samostatnou kapitolou je ekonomika pěstování luskovin, včetně rozsáhlých příloh.

Byl studován vliv prostředí (ročníku a geografické polohy) a genetická variability na stabilitu vybraných isozymových markerů: esterase (EST), acid phosphatase (ACP), alcohol dehydrogenase (ADH), leucine aminopeptidase (LAP), shikimate dehydrogenase (SDH) a glucose-6-phosphate isomerase (PGI), společně v DNA markery (RAPD, SSR, ISSR, IRAP) na 5 odrůdách hrachu setého, 4 let a 3 lokalitách.

Byla získána data o šíření mikrosatelitních repetic v genomu rostlin čeledi Fabaceae pomocí transpozice nového Ty1-copia MARTIAN 8.5 kb long retrotransposonu. Tento byl isolován a popsaná z genomu hrachu setého, na základě analýzy 45 SSR sekvencí nesoucích TC repetici. Byla zjištěna vysoká evoluční konzerovanost především koncové LTR oblasti v rámci čeledi Fabaceae.

Various modifications of Agrobacterium-mediated transformation of flax were tested with the aim of imroving the efficiency of transformation. We tested different conditions as epidermis removal, different cocultivation additives and times of cocultivation duration. The transformation efficiency was measured by GUS expression in explants after 3 weeks on selection medium using the Image Analysis DIA. The introducted genes should enhance the heavy metal accumulation to flax.

Grain Legumes Technology Transfer Platform (GL-TTP) was initiated in 2005 by the EU Grain Legumes Integrated Project (GLIP) to ensure the exploitation of the project outputs by the grain legume industry. GL-TTP has been created to facilitate collaborative efforts for carrying out scientific survey and making value of technology for the purposes of applied legume crop breeding. It aimed to facilitate and expedite the genetic improvement of grain legume varieties to suit the needs expressed by the grain legume producers and end-users. However upon GLIP termination in 2008 it was difficult to maintain it viable. Inspite of this second GLTTP worshop was held in late 2009 in Serbia, with over 80 participants. In parallel European Association for Grain Legume Research (AEP) exist, but face difficulties. It has been proposed to either fuse together or establish novel broader society.

Bobovité (Fabaceae Endl.) patří mezi nejrozsáhlejší čeledi rostlin na Zemi, zahrnující přez 800 rodů a 20 tisíc druhů na všech kontinentech. Mnoho z těchto zástupců jsou ekonomicky důležité plodiny, využívané pro rozmanité účely, včetně potravin, krmiva pro hospodářská zvířata a množství technologických účelů. Luskoviny byly člověku známé rozhodně již dříve, než se započalo s jejich pěstováním. Tak jako u ostatních rostlin, proces domestikace a pěstování vedl k morfologickým změnám, které velmi připomínají postupy výběru současných šlechtitelských programů. V případě luskovin hlavními kritérii výběru byly: 1). nepukavé lusky, 2). větší velikost semen, 3). hladké a tenčí osemení a 4). snížení či eliminace antinutričních nebo přímo toxických obsahových látek. První doklady o znalosti luštěnin u Slovanů jsou z období 3. až 2. století př.n.l, u obyvatelstva Ukrajiny, běloruského Polesí a Podněpří.

Luskoviny patřily mezi první rostliny, které zemědělci pěstovali. Fazol se pěstoval nejdříve v Mexiku, bob a hrách na Středním východě, sója a vigna v Číně. Kromě vysokého obsahu bílkovin mají luštěniny zanedbatelnou energetickou hodnotu a naopak obsahují vlákninu. Luštěniny jsou odjakživa známé jako bohatý zdroj bílkovin. Obsahují však mnohem větší spektrum dieteticky cenných látek, jako jsou: vláknina, složité cukry, rezistentní škrob. Jsou také velmi dobrým zdrojem vitamínů a minerálních látek, především kyseliny listové, draslíku, v současnosti velmi propagovaného selenu a zinku. Naopak obsahují jen velmi málo tuku a jako rostlinná potravina, neobsahují cholesterol. Zdravotnické organizace všeobecně udávají, že bychom měli během týdne sníst alespoň 0,5 kg luštěnin.

Leguminosae includes many economically important and versatile plants, with those used for grains and pulses representing the largest share of cultivated species. The classification of Pisum L. based on morphology and karyology has changed over time . Currently two species P. fulvum Sibth. & Sm. and P. sativum L. are recognized. The taxonomic position of P. abyssinicum is often discussed; whether this lineage has diverged sufficiently from other taxa to be considered a separate species or whether should be placed within P. sativum as a subgroup. Recent phylogenetic studies using various molecular markers have shown close relationship of Pisum to Lathyrus and Vicia. It is undoubtedly nested in Vicia, perhaps in Lathyrus as well, and is very closely allied to Vavilovia.

Crop genetic diversity, being crucial for feeding humanity as well as for the environment, continues to be reduced. Pea (Pisum sativum L.) as one of the oldest domesticated crops ranks as the fourth widely grown legume. Its seeds serve as a protein-rich food and feed source. Many studies have been conducted on Pisum germplasm collections to investigate genetic and trait diversity. It is also important for breeders to know the genetic basis of cultivars, especially whether they have become too narrow in diversity to render the crop vulnerable to disease or pests. Genetic structure of defined populations have been investigated by various molecular marker approaches. Defining a pea core together with a set of markers, will provide a basis for comparison of phenotypicand molecular analyses.

Pea Enation Mosaic Virus (PEMV) and Pea Seed-borne Mosaic Virus (PSbMV) represent very important economical risks for pea growers by 10-25% decrease of seed yield. In our study, the induction of virus resistance / tolerance in transgenic pea lines were developed by the introgression of full length as well as fragments of cDNA of the PEMV and PSbMV viral coat proteins which were cloned in sense and antisense orientations into pGreenII plasmid (John Innes Centre, Norwich, UK). The level of virus replication after mechanical inoculation was monitored by time-sequenced DAS-ELISA. In transgenic pea lines T3 with PSbMV coat protein fragments the concentration of virus RNA was after 14 days transiently enhanced (in average up to 125%), but after 28 days the mean of RNA concentration was 37% as compared to the control non-transgenic inoculated plants (100%).

Vavilovia formosa (Steven) Fed., a small, patch-forming perennial found in upper-alpine screes of the Caucasus, eastern Turkey, northern parts of Iraq, Iran, Syria and Lebanon. Unlike Pisum, the leaflets of Vavilovia unroll rather than unfolding (supervolute rather than conduplicate vernation), and it is a perennial, rhizomatous plant. In these respects and in its ecology, Vavilovia markedly differs from wild and cultivated Pisum and resembles Lathyrus. Species relationships were determined for 31 species of tribe Fabeae using sequences for four regions known to be informative for the group ; the maturase K, trnL-F and trnS-G spacer regions of chloroplast DNA, and the internal transcribed spacer (ITS) region of nuclear DNA. Maximum parsimony and Bayesian analysis of combined sequence data confirmed Vavilovia as a separate group positioned between Lathyrus and Pisum.

Byly vytvořeny protokoly agrobakteriální transformace hrachu, které využívají klasickou tkáňovou kulturu (regeneraci mnohonásobných prýtů z děložních segmentů a somatickou embryogenezi z apikálních meristémů) a systém bez využití tkáňových kultur (regenerace rostlin z upravených semen). Transgeny byly stabilně děděny v generacích T1-T3. Všechny transgenní rostliny byly morfologicky normální a fertilní.

164 položek hrachu, představujících české a slovenské šlechtění během posledních 50 let bylo analyzováno pomocí mikrosatelitních, retrotranspsonových a klasických morfoligickým markerů. Celkem bylo použito 10 SSR a 31 RBIP lokusů, společně s 15 kvalitativními a 18 kvantitativními morfologickými znaky. Bylo provedeno vyhdonocení pomocí Wardovy metody s odhadem 9 shluků na základě molekulárních dat a 5 až 7 shluky na základě morfologických znaků. Dále byly spočteny hodnoty PCA a MDS. Pro možnost integrace obou typů dat byla využita Bayesiánká metoda analýzy, na jejímž základě bylo vybrano 34 položek do core kolekce, plně representujících genetickou diverzitu původní kolekce. Porovnání genetické diverzity všech sledovaných znaků výchozí a core kolekcí, potvrdilo vhodnost této metody.

V příspěvku jsou konfrontovány data získaná ze znalosti genomu modelových rostlin se současnými možnostmi jejich využití pro šlechtění plodin, s důrazem na luskoviny. Od genových sbírek jako zdroje cenných vlastností, DNA markery až po GMO technologie.

Presentovány jsou specifická data z oblasti transkriptomiky, genomiky, proteomiky modelových luskovin v konfrontaci s plodinami jako je hrách, bob a jiné luskoviny.

Jsou presentovány současné možnosti genetiky a genomiky luskovin na příkladu hrachu setého. Je presentována situace luskovin v evropském a celosvětovém měřítku.

Several large germplasm collections of the Pisum genus are maintained world-wide. To facilitate their management and increase efficiency of their use, a core collection is being currently developed. Traditionally descriptions were made for germplasm accessions by morphological descriptors, together with known pedigree and passport data. In recent years genetic structures of pea germplasm collections have been investigated by several molecular marker approaches. However, after data processing, further use of such data is limited, in the absence of cross-comparison between collections. The key points for the future should be adoption of a common set of markers applied across the developed core sets, together with the deposition and availability of both molecular and agronomical data, creating a virtual world-wide pea germplasm resource for our common benefit.

Byla získána data o šíření mikrosatelitních repetic v genomu rostlin čeledi Fabaceae pomocí transpozice nového Ty1-copia MARTIAN 8.5 kb long retrotransposonu. Tento byl isolován a popsaná z genomu hrachu setého, na základě analýzy 45 SSR sekvencí nesoucích TC repetici. Byla zjištěna vysoká evoluční konzerovanost především koncové LTR oblasti v rámci čeledi Fabaceae.

Pro zvýšení procenta transformovaných pletiv na explantátech po kokultivaci s Agrobacteriem byl sledován vliv odstranění epidermis z hypokotylu, vliv různé doby kokultivace a různých koncentrací acetosyringonu. Efektivita transformace byla porovnávána na základě GUS zabarvení explantátů po 3 týdnech od kokultivace pomocí obrazové analýzy. Na základě statistického hodnocení výsledků obrazové analýzy byla vyhodnocena jako neefektivnější koncentrace 100mg/l acetosyringonu a doba trvání kokultivace 10 minut. Odstranění epidermis zvýšilo procento transformovaných pletiv o 11,75 %.

Práce se zaměřila na identifikaci bodových mutací v kódující čáasti genů FAD3A a B pro desaturázy lnu, projevující se nízkým obsahem kyseliny linolenové. Byly ověřeny a dále vyvinuty CAPS PCR markery umožňující efektivní výběr. V případě hrachu byla ověřeny a na roszáhlem souboru deklarovaných donorů testovány recesivní mutace v genu eIF4E/sbm-1 lokusu. Byly vyvinuté nové spolehlivé PCR markery využitelné ve šlechtitelském procesu.

Pro transformace hrachu byl vytvořen nový konstrukt s fúzním proteinem SPI2:GFP tak, aby byla možná nedestruktivní detekce transformovaných tkání a studium lokalizace v buňce. Vstupní kazeta pUCA7-TX s genem gmspi2 – proteázovým inhibitorem izolovaným z hedvábí fúzovaným sekvencí GFP (green fluorescent protein) pod promotorem 35S (triple X) a OCS terminátorem.

Standartní protokol pro transformaci lnu byl upraven na základě porovnání vlivu různých koncentrací celulázy a pektinázy při kokultivaci hypokotylů s Agrobacteriem, nesoucím konstrukt s vloženým genem pro zvýšenou akumulaci těžkých kovů. Efektivita transformace byla porovnávána na základě GUS zabarvení explantátů po 3 týdnech od kokultivace pomocí obrazové analýzy. Na základě statistického hodnocení výsledků obrazové analýzy byla vyhodnocena jako neefektivnější koncentrace 200mg/l celulázy.

Práce se zabývala studium a dohadem spolehlivosti jednotlivých metod na souboru 25 v CR doporučených odrůd hrachu. Tyto byly popsány jednak pomocí 12 morfologických deskriptorů, tak i 2 isozamových, 10 mikrosatelitních a 2 retrotransposonových systémů. Bylo zjištěno, že především techniky založené na analýze DNA umožňují vysokou spolehlivost a přesnost, navíc pak rychlost a nezávislost na vlivu prostředí. Jako nejspolehlivější metoda z hlediska jednoduchosti provedení byla retrotransposonová v lokus specifickém formátu RBIP, následovaná analýzou mikrosatelitních lokusů. Retrotransposonová vícelokusová IRAP metoda, společně s analýzou isozymů pak umožňila vyhodnocení s menším rozlišením, ale v jediné analýze. Bylo provedeno statistické vyhodnocení a porovnání všech metod.

Pomocí molekulárních metod byla studována genetické a epigenetická stabilita dlouhodobé in vitro kultury vzrostných prýtů hrachu. Mikrosatelitními a retrotransposonovými markery nebyla zjištěny žádné významné změny. Tyto byly detekovány pouze pomocí metylačně citlivé analýzy (MSAP), kdy byl zjištěn 11 a 18% polymorfismus. Tyto změny v metylaci genomové DNA byly potvrzeny pomocí měření celkového zastoupení metyl-cytosinu metdou HPCE.

Byly presentovány poslední výsledky práce na analýze genetické diversity kolekce hrachu a vyhodnocení získaných morfologických a molekulárních dat pomocí klasických metod založených na analýze genetické vzdálenosti, tak i novějších pomocí Bayesovského přístupu modelování umožňující integrace obou typů dat. To umožnilo zjištění přesnější struktury hodnoceného souboru.

Byla studována genetická diverzita 164 položek hrachu českého a slovenského původu pomocí 12 SSR, 25 RBIP a 2 IRAP molekulárních markerů, společně s 42 morfologickými deskriptory. Získaná data byla analyzována pomocí výpočtu genetických vzdáleností a následné shlukové analýzy. Morfologická data takto rozdělila studovaný soubor na 5 až 7 shluků, zatímco molekulární pak na 6 až 7. Pro možnost integrace abou systémů byla využita Bayesiánská analýza pomocí BAPS software, jež vyústila v postupné odlišení shluků. Rozdělení souboru dle šlechtitelských period pak naznačilo existenci zůžení genetického spektra.

Dva druhy plasmidů obsahující (1) celou sekvenci obalového proteinu viru cpPEMV nebo (2) fragmenty cpPEMV a cpPSbMV byly klonovány do pGreenII plasmidu a inzertovány do hypervirulentního kmene Agrobacterium tumefaciens EHA 105 spolu s pomocným plasmidem pSoup. Transformace rostlin hrachu byla provedena podle rutinního protokolu a potomstvo prokazatelně transgenních rostlin bylo analyzováno molekulárními metodami a biologickými testy. Úroveň tolerance / rezistence transgenních rostlin byla hodnocena po mechanické inokulaci PEMV, resp. PSbMV transgenních rostlin ve srovnání s kontrolami. Úroveň replikace viru byla hodnocena postupně časovanou DAS-ELISA. Exprese transgenů a úroveň replikace viru v transgenních rostlinách byla analyzována real-time PCR.

Byla prezentována nová data pro hodnocení genetické stability somatických embryí, embryogenních kalusů, neembryogenních kalusů a R0-regenerantů ze somatické embryogeneze ve srovnání s výchozím explantátem pomocí moderních molekulárních metod (tři odlišné DNA metody - SSR, IRAP, AFLP). Žádné profilové alternace mezi vzorky nebyly nalezeny. V případě metylačně citlivých variant byl detekován 4-8% polymorfismus.

Cílem práce byla analýza genetické variability souboru 19 odrůd lnu, které jsou v současnosti registrovány v České republice. K analýze byly využity tři různé molekulární techniky (RAPD, SSR, IRAP).

U 5 položek-odrůd hrachu byla pomocí 15 SSR lokusů studována možnost genetické driftu. Tyto položky byly representovány 2-3 časovými vzorky. V případě 3 položek byla existence genetické driftu potvrzena a diskutován její vliv na integritu genových kolekcí hrachu.

V této studii bylo analyzováno celkem 163 položek hrachu českého původu, 150 holandského a 130 německého, pomocí hodnocení 42 morfologickými a mikrosatelitními a retrotransposonovými markery. Data byla hodnocena jednak pomocí klasických výpočtů genetické vzdálenosti a shlukové analýzy, tak aplikací Bayesiánské metody umožňující spojení obou typů dat. Tyto metody byly porovnány z hlediska cílové aplikace - výběru core kolekce.

Cílem práce bylo vyvinout markerovací systém založený na využití retrotransposonových sekvencí pro analýzu genetické diverzity kolekce lnu. Celkem bylo osekvenováno více než 100 kb a následně identifikováno celkem 27 odlišných retrotransposonových fragmentů. Následně bylo navrženo a testováno 75 PCR primerů z nichž 23 poskytly reprodukovatelný polymorfní profil. Tento systém byl testován na souboru 50 geograficky odlišných položkách lnu z kolekce Agritec, CR. Tyto výsledky poslouží k dlaší práci s cílem tvorby core kolekce lnu na pracovišti Agritec, ŠUmperk.

Presentace výsledků analýzy morfologických a molekulárních dat vybraných 180 položek hrachu pomocí 42 morfologických, 10 mirkosatelitních a 27 retrotransposonových markerů. Tyto data byly podrobeny shlukové analýze, analýze genetické vzdálenosti a následně konstruovány dendrogramy příbuznosti.

Jsou popisovány postupné kroky tvorby core kolekce Linum usitatissimum L. Byla analyzována první část genotypů kolekce označených X13 (současné moderní odrůdy) z hlediska pasportních a popisných deskriptorů zahrnujících morfologické znaky a biologické charakteristiky. Byla hodnocena genetická variabilita jednotlivých morfologických znaků a na základě shlukové analýzy byly genotypy rozděleny do 40 shluků, z nichž shluky s největším zastoupením genotypů byly charakterizovány.

Kmín (Carum carvi L.) je tradiční miříkovitou léčivou a cizosprašnou rostlinou. Konvenční šlechtitelské metody se soustředěné na vysoký výnos a kvalitu silice v semeni jsou omezeny nízkou genetickou proměnlivostí (Nemeth 1998, Evenhuis et al. 1998). Současná studia rodu Daucaceae nenásledují možnosti dihaploidních rostlin přes in vitro pylovou embryogenezi kromě mrkve (Andersen et al. 1990, Adamus a Michalik 2003). Pro ověření schopnosti tvorby DH rostlin u kmínu bylo testováno 10 vybraných genotypu ozimého kmínu. Stav ploidie z regenerovaný rostlin byl analyzovaný pomocí flow-cytrometrie. Začátek pylového vývoje z normální gametogeneze k sporogenezi byla zjištován metodami světelné a fluorescenční mikroskopie. Donorové, haploidní, dihaploidní, andiploidní rostliny byly srovnávané analýzou esterasáz (EST) pro rozlišení pylového nebo prašníkového původu regenerujících rostlin. Četnost indukce embryogeneze byla nízká. Mikroskopie metoda ukázala asynchronní vývoj pyl uvnitř prašníků.

Publikace popisuje vývoj nového DNA markerovacího systému využívajících v genomu hrachu abundatních Ty3-gypsy typ retrotransposonových elementů aplikovaný ve schématu inter-retrotransposonového amplifikovaného polymorfismu (IRAP). Metoda demonstruje spolehlivost a efektivitu identifikace geneticky blízce příbuzných odrůd hrachu.

Byla provedena izolace SSR markerů. Bylo sekvenováno 30 vzorků, pouze 2 z nich obsahovaly repetitivní motiv. Nově vyvinuté SSR markery byly otestovány na souboru 10 kontrastních odrůd lnu. Jeden z markerů byl polymorfní v rámci testovaného souboru odrůd.

Jednalo se o presentaci využití repetetivní DNA sekvencí jako jsou mikrosatelity a retrotransposony dominujících eukaryotické genomy pro studium genetické struktury populací, nástroj analýzy architektury genomu. Byly oddiskutovány jednotlivé metody využívající tyto sekvence.

Na 5 lokalitách ČR by uskutečněn sběr izolátů virových patogenů PEMV a PSbMV (determinace symptomy na rostlinách a ELISA), které byly dále charakterizovány biologickými a molekulárními testy. Izoláty s nejvyšší patogenitou bly vybrány pro sekvenování a vývoj konstruktu pro transformaci hrachu. Strategie indukce rezistence byla založena na pathogen-derived resistance (PDR) a post-transkripčním urišování genů (PTGS). Komerční odrůdy byly transformovány a byly získány T1 rostliny s GUS/PCR pozitivní reakcí. Na těchto rostlinách bude dále studována reakce na virovou infekci.

Postup agrobakteriální genetické transformace vycházející ze trí ruzných regeneracních systému (indukce organogeneze z apikálních meristému, nodálních segmentu a regenerace upravených klícících semen) byl overen u 6 genotypu. Byly odzkoušeny ruzné podmínky kokultivace - vliv sonikace, vakuové infiltrace, chemických aditiv (acetosyringone, azacytidine, glutathione, dithiothreitol, L-cystein) a optimalizovány podmínky pro jednotlivé regneracní systémy. Potenciálne transgenní linie byly testovány histochemicky a analyzovány molekulárne PCR a Southern blot. Prenos transgenu byl overen do generace T3. Metodika je pripravena pro transformace konstrukty nesoucími šlechtitelsky a spotrebitelsky využitelné vlastnosti.

Byla presentována metoda transformace rostlin hrachu setého pomocí agrobakteriální transformace jednak s využitím in vitro a také in vitro protokolů. demonstrovali jsme úspěšnou transformaci s využitím pBIN19 konstruktu obsahujícím T-DNA s reporterovým genem GUS pro histochemickou detekci a selekčním markerem genu NPTII rezistence ke kanamycinu aplůikovaný na 6 genotypech hrachu. byla nalezeny optimální podmínky transformace a integrace transgenu byla prokázána pomocí PCR a Southern blotingu v regenerantech T1 a T3 generace.

Pomocí 42 morfologických a několika molekulárních markerů, 6 SSR, 25 RBIP a 2 IRAP retrotransposonových markerů bylo získáno celkem 51 hodnotitelných znaků, na jejichž základě byly vypočítány genetické vzdálenosti a provedena shluková analýza jednak morfologických tak i DNA dat. Zjištěná genetická struktura poslouží jednak k cílovému získání core kolekce, odstranění duplikací a racionalizaci šlechtění.

Byly presentovány současné možnosti využívající poslední poznatky genomiky leguminoz a jejich aplikace při studiu genetické diversity kolekcí hrachu. Zvláštní pozornost byla věnována mikrosatelitním a retrotransposonovým markerům.

Byla provedena klasifikace 34 aktuálně pěstovaných odrůd hrachu registrovaných v České republice pomocí 42 morfologických deskriptorů, 3 isoenzymových biochemických markerů, 8 mikrosatelitních (SSR) a 2 retrotransposonových DNA markerů. Pro práci byly zvoleny takové molekulární metody, které jsou relativně jednoduché, levné a rychlé. Získané výsledky demonstrují možnosti a odlišovací schopnosti metod založených na DNA.

Účinné regenerační systémy patří k nejdůležitějším předpokladům úspěšné genetické transformace. Obecně je většina luskovin považována za obtížně geneticky transformovatelné. V případě hrachu byly pro genetickou transformaci pomocí Agrobacteria využity tři techniky (embryogeneze, organogeneze a in vivo). Plazmid obsahoval reporterový gen uidA a selekční geny nptII nebo bar.

S využitím kontinuální 23leté organogenní in vitro kultury hrachu jsme sledovali její genetickou stabilitu pomocí molekulárních metod.

Na příkladu registrovaných odrůd hrachu jsme ukázali současné možnosti molekulární biologie ve srovnání s biochemickými, isozymovými a klasickými morfologickými deskriptory. Důraz byl kladen na přesné odlišení i geneticky velmi příbuzných odrůd hrachu pomocí mikrosatelitních a retrotransposonových markerů.

S využitím organogenní kontinuální in vitro kultury hrachu, založené před 21 lety, byla pomocí molekulárních markerů a flow-cytometrie studována genetické stabilita ve srovnání s původním osivem. Byla konstatována stabilita jak na úrovni ploidie, tak rovněž na úrovni retrotransposonových a mikrosatelitních markerů.

Byly presentovány výsledky z vývoje nové molekulární metody založené na využití retrotransposonových sekvencí pro studium genetické struktury kolekce hrachu a za účelem identifikace odrůd. Bylo provedeno srovnání rozlišovací schopnosti s ostatními současnými molekulárními metodami.