Griga Miroslav, RNDr., CSc.

SMÝKALOVÁ, Iva, Karel DOLEŽAL, Lenka PLAČKOVÁ, Lucie PLÍHALOVÁ, Marek ZATLOUKAL a Miroslav GRIGA, 2025. The effect of supplementing in vitro flax (Linum usitatissimum L.) culture media with a synthetic cytokinin derivative (BAP9 THP) and a cytokinin metabolism modulator (INCYDE). Plant Growth Regulation [online]. [vid. 2025-04-28]. ISSN 1573-5087. Dostupné z: doi:10.1007/s10725-025-01326-2

HORÁČEK J., M. GRIGA a M. SEIDENGLANZ. Compositional assessment of transgenic and non-transgenic pea (Pisum sativum L.). Výzkum v chovu skotu. 2022, 64(3), 15–24. ISSN 0139-7265. Dostupné z: http://www.vuchs.cz/soubory/bulletin/2022/3/bull_3_2022_15-24_horacek.pdf

BERKOVA, Veronika, Miroslav BERKA, Miroslav GRIGA, Romana KOPECKA, Miroslava PROKOPOVA, Marketa LUKLOVA, Jiri HORACEK, Iva SMYKALOVA, Petr CICMANEC, Jan NOVAK, Bretislav BRZOBOHATY a Martin CERNY, 2022. Molecular Mechanisms Underlying Flax (Linum usitatissimum L.) Tolerance to Cadmium: A Case Study of Proteome and Metabolome of Four Different Flax Genotypes. Plants-Basel [online]. 11(21), 2931. Dostupné z: doi:10.3390/plants11212931

LUDVÍKOVÁ, Michaela a Miroslav GRIGA, 2022. Pea transformation: History, current status and challenges. Czech Journal of Genetics and Plant Breeding [online]. 58 (2022)(No. 3), 127–161. ISSN 18059325. Dostupné z: doi:10.17221/24/2022-CJGPB

LUDVÍKOVÁ, M., GRIGA, M. a HANÁČEK, P. Tvorba konstruktu pro indukci RNA interference genu fad2-1 u lnu. Výzkum v chovu skotu. 2022, 64(2), 15–27. ISSN 0139-7265. Dostupné z: http://www.vuchs.cz/soubory/bulletin/2022/2/bull_2_2022_15-27_ludvikova.pdf

SMÝKALOVÁ, Iva, Miroslava VRBOVÁ, Magdalena CVEČKOVÁ, Lenka PLAČKOVÁ, Asta ŽUKAUSKAITĖ, Marek ZATLOUKAL, Jakub HRDLIČKA, Lucie PLÍHALOVÁ, Karel DOLEŽAL a Miroslav GRIGA, 2019. The effects of novel synthetic cytokinin derivatives and endogenous cytokinins on the in vitro growth responses of hemp (Cannabis sativa L.) explants. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC) [online]. 139(2), 381–394. ISSN 1573-5044. Dostupné z: doi:10.1007/s11240-019-01693-5

GRIGA, Miroslav, Eva TEJKLOVÁ, Iva SMÝKALOVA, Magdalena CVEČKOVÁ, Lenka ŠVÁBOVÁ, Martina VĚTROVCOVÁ, Miroslava VRBOVÁ a Jiří HORÁČEK. Utilization of doubled-haploid technology in the breeding programmes of winter oilseed rape, flax/linseed, caraway, pea, poppy and hemp in Agritec Ltd. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant. 2018, 54, S82–S82. ISSN 1054-5476.

HILGERT, Jitka, Martina SURA-DE JONG, Jiří FIŠER, Kateřina TUPÁ, Miroslava VRBOVÁ, Miroslav GRIGA, Tomáš MACEK a Jana ŽIAROVSKÁ. The use of phosphomannose isomerase selection system for Agrobacterium-mediated transformation of tobacco and flax aimed for phytoremediation. Journal of Environmental Science and Health Part B-Pesticides Food Contaminants and Agricultural Wastes [online]. 2017, 52(5), 338–345. ISSN 0360-1234. Dostupné z: doi:10.1080/03601234.2017.1283136

PLAČKOVÁ, Lenka, Jakub HRDLIČKA, Iva SMÝKALOVÁ, Magdalena CVEČKOVÁ, Ondřej NOVÁK, Miroslav GRIGA a Karel DOLEŽAL, 2015. Cytokinin profiling of long-term in vitro pea (Pisum sativum L.) shoot cultures. Plant Growth Regulation. Roč. 77, č. 2, s. 125–132. ISSN 0167-6903, 1573-5087. Dostupné z: doi:10.1007/s10725-015-0044-z

Czech Journal of Genetics and Plant Breeding. 2015, 51(4), 123–141. ISSN 1212-197. Dostupné z: doi:10.17221/104/2015-CJGPB. [WOS:000365986200001]

V letech 2012 až 2014 byl studován vliv různých forem selenu, jeho příjem a potenciální toxicita u in vitro kultur lnu pro účely biofortifikace. V práci byly použity komerční odrůdy olejného lnu (Raciol, Amon), které byly testovány na pevných médiích a vybraných koncentracích selenu u kultur mnohonásobných prýtů. Selen ve formě seleničitanu sodného Na2SeO3 nebo selenanu sodného Na2SeO4 byl přidán do médií v následujících koncentracích: A = 0μM; B = 10 μM; C = 50 μM; D = 100 μM. U jednotlivých variant byl sledován vliv použitých forem selenu na růstové parametry a obsah selenu v biomase. Předběžné výsledky ukazují na stimulaci růstu v nízké koncentraci selenu při použití obou forem. Nicméně množství čerstvé biomasy během kultivace bylo vyšší v případě Na2SeO4, což se projevilo i menší toxicitou v in vitro kulturách lnu.

In an attempt to enhance the phytoextraction capacity of L. usitatissimum through overproduction of an efficient heterologous Cd-binding peptide, we engineered linseed breeding line AGT 917 to constitutively express genetic fusion of α-domain of mammalian metallothionein 1a (αMT1a) and β-glucuronidase gus gene under the control of CaMV 35S promoter. An improved transformation protocol was developed. When tested in soils amended with Cd at 20 and 360 mg kg-1, the mature αMT1a::gus plants accumulated more Cd than parental AGT 917: the stem Cd concentrations in the best performing αMT1/2 line were 3.3- and 1.9-fold higher, respectively. Moreover, hypocotyl explants of αMT1/2 line showed 1.7-fold higher biomass than those of AGT 917 on media containing 15 mg Cd l-1, indicating that αMT1a::gus did confer higher Cd tolerance to engineered plant. Overproduction of metal-binding peptides thus appears to be a viable strategy for the production of L. usitatissimum with improved phytoremediation capacity

Fibre crops are world-wide distributed group of plant species belonging taxonomically to various plant families. The common denominator is their use of above-ground biomass for mainly industrial (non-food) or energy purposes. They include approximately 2,000 species—annual and perennial—belonging to monocotyledonous as well as dicotyledonous plants. About 20 species have got an economical (some of them local) importance. Majority of fibre species is grown in tropical and subtropical zones. Cellulose, a natural polymer with high strength and stiffness per weight, is the building material of long fibrous cells, which can be found in the stems, the leaves or the fruits/seeds of fibre plants. Thus, based on the fibrous cells localisation within the plant, we can recognise bast fibre species (e.g. flax, hemp, jute, kenaf, ramie and sida), leaf fibre species (sisal, banana and palm) and fruit/seed fibre species (cotton, coconut, kapok and luffa). During last 20 years, the fibre crops have been also considered as potential candidates for phytoremediation, particularly for phytoextraction of heavy metals from contaminated soils. Within fibre crops of temperate and subtropical zone, flax/linseed and hemp represent economically the most important species and also the majority of heavy metal-related experimental data were obtained and published in these two fibre crops. Here we bring information on biological potential of flax and hemp for heavy metal phytoextraction, the possibilities of agrotechnological treatments to affect/improve heavy metal uptake and, finally, the economical assessment of phytoremediation technology for flax and hemp growers and phytoremediation operators.

Plant transformation may be defined as the sequence of delivery, integration and expression of foreign genes into the plant cells which will ultimately regenerate into a whole plant. This ability to introduce and express or inactivate specific genes in the plant genomes provides a new and powerful experimental tool for validating gene function, particularly in relation with various plant physiology mechanisms and processes that have not been resolved so far using other biochemical approaches. Another non-negligible application of this approach is that of obtaining and transferring genes that are not available to a given species due to sexual incompatibility from other plants, from microorganisms or even animals. The process involves choosing a trait, identifying and isolating the gene(s) encoding it. To be functional, such gene(s) must include the regulatory regions ensuring their correct expression in the plant. Then, a reliable protocol must be devised and followed for the transformation of genes into plants, and the DNA sequences introduced must subsequently be integrated, expressed and maintained in the genome throughout subsequent cell divisions and progenies. Finally, transformed cells must be competent for regeneration into whole plants. Gene delivery systems used to date can be divided into direct gene transfer (mediated by physical or chemical forces for delivery of the gene into plant protoplasts, cells and even tissues) and Agrobacterium-mediated gene transfer, where either A. tumefaciens or A. rhizogenes is used as vectors for introducing the foreign gene into the plant genome. In this context, recombinant DNA technology has revolutionised biotechnology in such a way that plant transgenesis is now a relatively mature approach, and plant biotechnology provides today not only novel genotypes which carry agronomically useful genes for biotic and abiotic stresses, but also others that improve plant nutrition or increase yield components.

Optimisation of two in vitro regeneration systems for low-tannine cultivars of faba bean based on culturing of shoot apices and cotyledonary nodes were provided by usage of various antioxidants - ascorbic acid, citric acid, glutathione and activated charcoal. In subsequent testing, the combined effects of antioxidants with transformation co-cultivation compounds acetosyringone and L-cysteine was studied. The application of antioxidants lead to decreased caullogenesis, citric acids treatments (50 mg.l-1) dramatically decreased necrotic response of explants. However, citric acid, used together with ascorbic acid completely inhibited shoot growth in shoot apex cultures. Glutathion evoked hyperhydricity of explants. Activated charcoal induced rooting on media which are commonly used for shoot proliferation. Combination of acetosyringone with antioxidants did not negatively influenced shoot proliferation, except of variant with ascorbic acid. Citric acid worked as the best and universal antioxidant in faba bean in vitro cultures utilizable and its use is recommended for faba bean genetic transformation experiments.

Changes in genetic diversity of peas bred in the Czech Republic and in former Czechoslovakia since the mid-20(th) century were analysed using 38 molecular marker loci, including retrotransposons and microsatellites, differentiating a total of 84 alleles. Both marker types were comparably effective in revealing the genetic diversity, with a high correlation (r = 0.81), although the pairwise genetic distances of each marker type differed. In total, 175 accessions, selected from the Czech pea gene bank collection and representing the pea cultivars collected or bred in the country, were divided into three groups according to their date of sampling or variety registration. The first group contained 70 old cultivars and landraces collected prior to 1961. The second group contained 46 cultivars released from 1961 to 1980. The third group contained 59 cultivars released between 1981 and 2004. In spite of the decline in several diversity measures, differences in allele frequencies and even allele loss in three microsatellite loci were recorded over the 70-year period, while these differences between the groups were not statistically significant. In addition, genetic heterogeneity was detected in 29 accessions (15%). This indicates that although no genetic erosion could be observed since then, it is important to monitor the genetic diversity, furthermore it highlights the vital role of germplasm collections for the crop diversity conservation.

The possibility of use of two technological types of Linum usitatissimum L., namely flax (grown for fibre) and linseed (grown for seed), for phytoextraction of cadmium (Cd) from Cd-contaminated soil was studied. A four-year field-simulated experiment was carried out with 6 flax and 4 linseed cultivars in order to study organ accumulation of Cd by flax and linseed plants at artificial concentration range 10 to 1000 mg Cd . kg-1 soil. The most Cd was accumulated by roots, followed by shoots, while reproductive parts (capsules and seeds) played comparably smaller role. The increasing soil Cd concentration resulted in increasing Cd accumulation by roots, while transport to above-ground plant parts was progresivelly inhibited. Even high soil Cd concentrations (1000 mg Cd . kg-1 soil) had not dramatic negative effect on plant growth and development.differences as well as the differences between both technological Linum types have been found in Cd accumulation (flax being better Cd accumulator than linseed). Nevertheless, the recorded variation between technological types and within is in multiples of Cd values (units of mg Cd . kg-1 DW), not in as needed for practical phytoextraction. A significant year-to-year effect on plant growth/development resulting in high variation in Cd accumulation was observed. Further, the contrasting in total Cd accumulation (high accumulating flax cv. Jitka versus low accumulating linseed cv. Jupiter) were selected for future experiments. The uptake of Cd by flax/ linseed from ha per season was calculated and the strategy for flax/linseed growing on heavy metal polluted soils with subsequent utilization of heavy metal-contaminated biomass is discussed.

Intact plants and in vitro cultures of four pea (Pisum sativum) cultivars (Adept, Herold, Komet, Menhir) that vary in their degree of susceptibility/resistance to Fusarium solani were inoculated with this pathogen or treated with its culture filtrates to compare their reaction patterns at the phenotypic, histological and biochemical level. Changes in activity of three peroxidase forms, cytosolic, membrane- and ion-bound, and in peroxidase isozymes were studied in detail. In addition, the length and weight of roots of regenerating plantlets in explant cultures as well as symptom expression in intact plants were assessed. In planta, screening of the four pea cultivars revealed the highest degree of resistance in cv. Adept, and the highest level of susceptibility in cv. Menhir both to F. solani and its metabolites. Regarding in vitro cultures, the microfiltrated filtrates had stronger inhibitive effect than the autoclaved ones. In terms of peroxidase activity, the only significant difference among cultivars was found in its ionic form, for the most resistant cv. Adept versus the most sensitive cv. Menhir. Minor changes in activity of cytosolic peroxidase were noted in planta and in vitro, while the membrane- and ion-bound peroxidase significantly decreased in explants. The aim of our study was to compare reaction of pea plants and explants and to verify whether the application of fungal filtrates is able to mimic the F. solani pathogenesis. Several responses of explants to filtrates were found to be analogous to the plant reaction to pathogen infection both at morphological and physiological levels. These can be utilized in an early in vitro screening for plant tissue resistance to F. solani.

Udržování genetické integrity kolekcí genových zdrojů je klíčovým cílem dlouhodobé ex situ konzervace. Periodicke regenerace, na malých pokusných parcelách s malým počtem rostlin, zvyšuje riziko genetického driftu a změn genetické rozmanitosti. V této studii, bylo hodnoceno šest bělokvětých odrůd polního hrachu (Pisum sativum L. subsp sativum var sativum): Bohaty'r, Klatovký Zelený , Hana'k, Moravský hrotovicky krajovy'', Raman a Viktoria -75 a čtyři odrůdy barevně kvetoucí, krmného hrachu (P. sativum subsp sativum var arvense (L.) Poiret: týden Arvika, C esky bana'n, Moravská Krajová "a Nike", což představuje československé odrůdy a krajové odrůdy , pěstované v posledních 40-80 letech. Byly analyzovány pomocí deseti mikrosatelitních lokus specifických markerů. Každá odrůda byla zastoupena 20 semeny, dvou vzorků různých období, překlenující období 20 nebo 40 let. Současně byla detekována vnitrodruhová variabilita (s výjimkou odr. Hana'k), jako důkaz genetických změn, např. rozdíly ve frekvencích alel , stejně jako genetickém složení vzorku, u šesti z deseti odrůd (Arvika, Bohaty'r, Cesky bana'n, Moravský "hrotovicky" krajovy ", Moravská To Krajová" a Raman). Důkaz genetické eroze byl nalezen ve třech odrůdách Cesky bana'n, Moravský hrotovicky krajovy "a Raman), zatímco u jiných tří (Arvika, Bohatyr a Moravská Krajová ") bylo zjištěno, že se zvýšila úroveň rozmanitosti. Navíc ve třech vzorcích Bohaty'r (2004) a Klatovský Zelený (o 1963 a 2004), byla zjištěna nízká úroveň heterozygotnosti . Tyto výsledky ukazují, že u hrachu, samosprašné a vysoce homozygotní rostliny, nebezpečí ztráty genetické integrity existuje. Tato zjištění jsou významná pro dlouhodobé ex situ vedení kolekcí.

Set of Czech pea cultivars was transformed by Agrobacterium-mediated transformation with construct containing protease inhibitor transgene gmSPI2, originated from salivary glands of Galleria mellonela. It was exprimed in Pichia pastoris and its high effectiveness to bacterial and fungal proteases was proved.T0 plants were histochemically tested for GUS expression, then, putative transformants were tested using PCR. From total ca 300 regenerated T1 lines, 150 samples of putative transformants were tested by PCR and more than 60 of them gave positive results. In total, the effectiveness of transformation ranged between 1-5% from initially established explants. Improved resistance to insects (Bruchus pisorum) and possibly also to some fungal pathogens (complex of leaf anthracnoses and root diseases) are expected.

SMÝKALOVÁ, Iva, Prokop ŠMIROUS, Michaela KUBOŠIOVÁ, Nikol GASMANOVÁ a Miroslav GRIGA, 2008. Doubled haploid production via anther culture in annual, winter type of caraway (Carum carvi L.). Acta Physiologiae Plantarum [online]. 31(1), 21. ISSN 1861-1664. Dostupné z: doi:10.1007/s11738-008-0195-x

Byl studován vliv prostředí (ročníku a geografické polohy) a genetická variability na stabilitu vybraných isozymových markerů: esterase (EST), acid phosphatase (ACP), alcohol dehydrogenase (ADH), leucine aminopeptidase (LAP), shikimate dehydrogenase (SDH) a glucose-6-phosphate isomerase (PGI), společně v DNA markery (RAPD, SSR, ISSR, IRAP) na 5 odrůdách hrachu setého, 4 let a 3 lokalitách.

Byla získána data o šíření mikrosatelitních repetic v genomu rostlin čeledi Fabaceae pomocí transpozice nového Ty1-copia MARTIAN 8.5 kb long retrotransposonu. Tento byl isolován a popsaná z genomu hrachu setého, na základě analýzy 45 SSR sekvencí nesoucích TC repetici. Byla zjištěna vysoká evoluční konzerovanost především koncové LTR oblasti v rámci čeledi Fabaceae.

Various modifications of Agrobacterium-mediated transformation of flax were tested with the aim of imroving the efficiency of transformation. We tested different conditions as epidermis removal, different cocultivation additives and times of cocultivation duration. The transformation efficiency was measured by GUS expression in explants after 3 weeks on selection medium using the Image Analysis DIA. The introducted genes should enhance the heavy metal accumulation to flax.

Výsledkem experimentů s genetickými modifikacemi hrachu za pomoci konstruktů na bázi fragmentů obalového proteinu virů výrůstkové mozaiky (Pea Enation Mosaic Virus – PEMV) a svinování listů hrachu (Pisum Seed-borne Mosaic Virus - PSbMV) byly linie hrachu se zvýšenou odolností k virovým patogenům. Přítomnost transgenů byla testována histologickým barvením genu GUS, molekulárními testy, odolnost linií byla ověřena v biologických skleníkových testech po mechanické inokulaci. Byly vyvinuty i další GM linie hrachu s transgeny získanými z genomu hmyzu, které by se měly vyznačovat odolností k hmyzím škůdcům a houbovým patogenům. Jejich genotypové vlastnosti a dědičnost transgenů jsou sledovány molekulárními metodami, fenotypové vlastnosti a odolnost bude postupně sledována ve skleníkových i polních testech v rámci výzkumných projektů ve firmě Agritec.

Pea Enation Mosaic Virus (PEMV) and Pea Seed-borne Mosaic Virus (PSbMV) represent very important economical risks for pea growers by 10-25% decrease of seed yield. In our study, the induction of virus resistance / tolerance in transgenic pea lines were developed by the introgression of full length as well as fragments of cDNA of the PEMV and PSbMV viral coat proteins which were cloned in sense and antisense orientations into pGreenII plasmid (John Innes Centre, Norwich, UK). The level of virus replication after mechanical inoculation was monitored by time-sequenced DAS-ELISA. In transgenic pea lines T3 with PSbMV coat protein fragments the concentration of virus RNA was after 14 days transiently enhanced (in average up to 125%), but after 28 days the mean of RNA concentration was 37% as compared to the control non-transgenic inoculated plants (100%).

Byly vytvořeny protokoly agrobakteriální transformace hrachu, které využívají klasickou tkáňovou kulturu (regeneraci mnohonásobných prýtů z děložních segmentů a somatickou embryogenezi z apikálních meristémů) a systém bez využití tkáňových kultur (regenerace rostlin z upravených semen). Transgeny byly stabilně děděny v generacích T1-T3. Všechny transgenní rostliny byly morfologicky normální a fertilní.

V projektu je studována reakce českých odrůd (Adept, Herold, Komet and Menhir) na inokulaci Fusarium solani a na ošetření filtráty upravenými autoklávováním a mikrofiltrací na úrovni intaktních rostlin a v kulturách in vitro. Cílem race je srovnání reakce in vitro a in planta a nalezení nejvhodnější varianty filtrate patogena pro selekce in vitro.

164 položek hrachu, představujících české a slovenské šlechtění během posledních 50 let bylo analyzováno pomocí mikrosatelitních, retrotranspsonových a klasických morfoligickým markerů. Celkem bylo použito 10 SSR a 31 RBIP lokusů, společně s 15 kvalitativními a 18 kvantitativními morfologickými znaky. Bylo provedeno vyhdonocení pomocí Wardovy metody s odhadem 9 shluků na základě molekulárních dat a 5 až 7 shluky na základě morfologických znaků. Dále byly spočteny hodnoty PCA a MDS. Pro možnost integrace obou typů dat byla využita Bayesiánká metoda analýzy, na jejímž základě bylo vybrano 34 položek do core kolekce, plně representujících genetickou diverzitu původní kolekce. Porovnání genetické diverzity všech sledovaných znaků výchozí a core kolekcí, potvrdilo vhodnost této metody.

Byla získána data o šíření mikrosatelitních repetic v genomu rostlin čeledi Fabaceae pomocí transpozice nového Ty1-copia MARTIAN 8.5 kb long retrotransposonu. Tento byl isolován a popsaná z genomu hrachu setého, na základě analýzy 45 SSR sekvencí nesoucích TC repetici. Byla zjištěna vysoká evoluční konzerovanost především koncové LTR oblasti v rámci čeledi Fabaceae.

Pro zvýšení procenta transformovaných pletiv na explantátech po kokultivaci s Agrobacteriem byl sledován vliv odstranění epidermis z hypokotylu, vliv různé doby kokultivace a různých koncentrací acetosyringonu. Efektivita transformace byla porovnávána na základě GUS zabarvení explantátů po 3 týdnech od kokultivace pomocí obrazové analýzy. Na základě statistického hodnocení výsledků obrazové analýzy byla vyhodnocena jako neefektivnější koncentrace 100mg/l acetosyringonu a doba trvání kokultivace 10 minut. Odstranění epidermis zvýšilo procento transformovaných pletiv o 11,75 %.

Práce se zaměřila na identifikaci bodových mutací v kódující čáasti genů FAD3A a B pro desaturázy lnu, projevující se nízkým obsahem kyseliny linolenové. Byly ověřeny a dále vyvinuty CAPS PCR markery umožňující efektivní výběr. V případě hrachu byla ověřeny a na roszáhlem souboru deklarovaných donorů testovány recesivní mutace v genu eIF4E/sbm-1 lokusu. Byly vyvinuté nové spolehlivé PCR markery využitelné ve šlechtitelském procesu.

Pro transformace hrachu byl vytvořen nový konstrukt s fúzním proteinem SPI2:GFP tak, aby byla možná nedestruktivní detekce transformovaných tkání a studium lokalizace v buňce. Vstupní kazeta pUCA7-TX s genem gmspi2 – proteázovým inhibitorem izolovaným z hedvábí fúzovaným sekvencí GFP (green fluorescent protein) pod promotorem 35S (triple X) a OCS terminátorem.

Byly porovnány biologické reakce dvou odrůd lnu na kadmium. Po vytvoření suspenze bylo přidáno kadmium v koncentraci 10, 50 a 100µM a byly odebírány vzorky v časových intervalech 3,12,24 a 48 hodin. Změny v hladině fytovhelatinů průkazně rostly v závislosti na rostoucí koncentraci kadmia. Koncentrace 50 µM se ukázala jako mezní, vyšší koncentrace 100 µM je pro buňky letální.

Standartní protokol pro transformaci lnu byl upraven na základě porovnání vlivu různých koncentrací celulázy a pektinázy při kokultivaci hypokotylů s Agrobacteriem, nesoucím konstrukt s vloženým genem pro zvýšenou akumulaci těžkých kovů. Efektivita transformace byla porovnávána na základě GUS zabarvení explantátů po 3 týdnech od kokultivace pomocí obrazové analýzy. Na základě statistického hodnocení výsledků obrazové analýzy byla vyhodnocena jako neefektivnější koncentrace 200mg/l celulázy.

Kombinace biolistické a agrobakteriální metody transformace umožňuje využít výhody obou transformačních systémů (přímého i nepřímého) pro různé rostlinné druhy. Termín agrolistika označuje metodu, která využívá biolistiku pro mechanické narušení explantátů a následnou kokultivaci v agrobakteriální suspenzi. Byl odzkoušen vliv acetosyringonu a L-cysteinu s cílem zvýšit efektivitu transformace.

Byl studován vliv chemických přídavných látek (acetosyringone,AS; L-cysteine, CYS; dithiothreitol, DTT; glutathione, GSH; cellulase, CEL; pectinase, PEC) a světelného režimu (16/8 den / noc, 16L/8D; stálé osvětlení, 24L; stálé zatemnění, 24D) během kokultivační periody explantátů hrachu s Agrobacterium tumefaciens na efektivitu transformace. Optimální podmínky byly stanoveny při 48h kokultivaci za 20+/-2 °C, 50 mg l-1 CYS, 100 µM AS, 16L/8D fotoperiodě.

Konopí kultivarů Benico, Monoica, Fibrol a Bialobrezskie byly pěstovány (2005, 2006, 2007) v přírodně simulovaných podmínkách půd (kontrola) a dále v půdách se zvýšeným obsahem kalů z čistíren odpadních vod vpoměru kalu: půdy: 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6. Zralé části rostlin konopí byly zkoumány pomocí atomové absorpční spektrometrie (AAS) pro jejich potenciál k absorpci a hromadění Cd, Pb Zn v semeni, plevách, listech, stonku a kořeni. Statistické vyhodnocení zaznamenaných dat (TK koncentrace a celková akumulace) byly provedeny analýzou variance a vícenásobným porovnáváním - LSD test, statistický program UNISTAT. Akumulace jednotlivých elementů do různých částí rostliny vykazovaly velké rozdíly. Transport Cd a Pb z vegetativních částí (kořen, stonek, listy) do generativních orgánů (tobolky, semena) byla výrazně omezena. Rostliny konopí akumulovaly nejvíce Zn, pak Pb a nejméně Cd.

Byla studována schopnost genotypů přadného a olejného lnu odebírat z kontaminované zeminy těžké kovy. Byly zjištěny značné diference v akumulaci těžkých kovů různých genotypů lnu, dále bylo prokázáno, že vybrané genotypy lnu jsou schopny akumulovat do svých orgánů těžké kovy, zvláště kadmium, které v orgánech a v dílčích částech rostlin lnu některých genotypů bylo obsaženo i v nadlimitních hodnotách.

Pomocí molekulárních metod byla studována genetické a epigenetická stabilita dlouhodobé in vitro kultury vzrostných prýtů hrachu. Mikrosatelitními a retrotransposonovými markery nebyla zjištěny žádné významné změny. Tyto byly detekovány pouze pomocí metylačně citlivé analýzy (MSAP), kdy byl zjištěn 11 a 18% polymorfismus. Tyto změny v metylaci genomové DNA byly potvrzeny pomocí měření celkového zastoupení metyl-cytosinu metdou HPCE.

Metoda biolistické transformace byla aplikována u hrachu a lnu. Cílem bylo optimalizovat podmínky nastavení parametrů přístroje BiolisticPDS-1000/He pro kultury in vitro u zájmových rostlinných druhů a vypracovat rutinní pracovní protokol. U hrachu byla současně porovnána účinnosti biolistiky a agrolistiky, u lnu byly odzkoušeny tři různé plasmidy s cílem optimalizovat specifické nastavení přístroje pro kultury lnu. Pro hrách bylo optimální nastavení tlak 1350 psí, FD15, L2, pro len 1100 psí, FD 15, L2. Agrolistika byla ve srovnání s biolistikou účinnější, po 23 dnech hodnocení GUS+ explantátů 16,5%, resp. 3,5%.

Byly presentovány poslední výsledky práce na analýze genetické diversity kolekce hrachu a vyhodnocení získaných morfologických a molekulárních dat pomocí klasických metod založených na analýze genetické vzdálenosti, tak i novějších pomocí Bayesovského přístupu modelování umožňující integrace obou typů dat. To umožnilo zjištění přesnější struktury hodnoceného souboru.

Cílem práce bylo studium potenciálu klasických proteinových markerů pro popis části genové kolekce rodu Pisum. Pro experimentální práci byl z kolekce vybrán soubor českých odrůd (celkem 165 položek). Semenné proteiny byly analyzovány metodou SDS-PAGE s následným barvením pomocí Coomasie Blue. Isoenzymy byly děleny metodou PAGE za nativních podmínek a jejich detekce byla prováděna pomocí běžných metod.

Dva druhy plasmidů obsahující (1) celou sekvenci obalového proteinu viru cpPEMV nebo (2) fragmenty cpPEMV a cpPSbMV byly klonovány do pGreenII plasmidu a inzertovány do hypervirulentního kmene Agrobacterium tumefaciens EHA 105 spolu s pomocným plasmidem pSoup. Transformace rostlin hrachu byla provedena podle rutinního protokolu a potomstvo prokazatelně transgenních rostlin bylo analyzováno molekulárními metodami a biologickými testy. Úroveň tolerance / rezistence transgenních rostlin byla hodnocena po mechanické inokulaci PEMV, resp. PSbMV transgenních rostlin ve srovnání s kontrolami. Úroveň replikace viru byla hodnocena postupně časovanou DAS-ELISA. Exprese transgenů a úroveň replikace viru v transgenních rostlinách byla analyzována real-time PCR.

Byla prezentována nová data pro hodnocení genetické stability somatických embryí, embryogenních kalusů, neembryogenních kalusů a R0-regenerantů ze somatické embryogeneze ve srovnání s výchozím explantátem pomocí moderních molekulárních metod (tři odlišné DNA metody - SSR, IRAP, AFLP). Žádné profilové alternace mezi vzorky nebyly nalezeny. V případě metylačně citlivých variant byl detekován 4-8% polymorfismus.

Cílem práce bylo studium elektroforetických spekter celkových proteinů v různých fázích vývoje somatických embryí hrachu při použití jednoduchého protokolu přímé regenerace z apikálních meristémů na médiu s přídavkem auxinu. V jednotlivých fázích vývoje somatických embryí byla provedena stanovení obsahu proteinů a také analýzy jejich elektroforetických spekter metodou SDS-PAGE. Exprese proteinů v somatických embryích byla porovnána s jejich tvorbou v zygotických embryích ve vybraných vývojových stádiích.

V této studii bylo analyzováno celkem 163 položek hrachu českého původu, 150 holandského a 130 německého, pomocí hodnocení 42 morfologickými a mikrosatelitními a retrotransposonovými markery. Data byla hodnocena jednak pomocí klasických výpočtů genetické vzdálenosti a shlukové analýzy, tak aplikací Bayesiánské metody umožňující spojení obou typů dat. Tyto metody byly porovnány z hlediska cílové aplikace - výběru core kolekce.

V naší studii byly studovány komerční odrůdy přadného a olejného lnu a jejich schopnost akumulovat CD, Pb, a Zn z půd a jejich selekční potenciál pro využití pro fytoextrakci. Byla prezentována předběžná data akumulace Cd, Pb a Zn rostlin přadných a olejných lnů a jejich rostlinných částí pěstovaných se směsi odpadních kalů a zeminy. Některé kultivary zadržely Cd a Pb v kořeni nebo ve vegetativních částech, tím vystavily tobolky a semena nízké translokaci (hledisko bezpečných potravin). V kontrastu Zn je translokován do generativních orgánů velmi snadno a obohacené lněné semeno zinkem slouží jako materiál pro vyživu.

V průběhu agrobakteriální transformace je kokultivace klíčovým krokem. Odrůdy polního hrachu Adept, Komet a Menhir byly použity v řadě experimentů s aplikací kokultivačních látek – acetosyringonu, L-cysteinu, dithiothreitolu, glutathionu, maceračních enzymů – celulázy a pektinázy. Byl také testován vliv režimu osvětlení – nepřetržité světlo nebo tma. Pozitivní vliv byl zaznamenán při aplikaci acetosyringonu a L-cysteinu. Glutathion neměl vliv na efektivitu transformace ani při opakování experimentů a při různých škálách koncentrací. Dithiotreitol a macerační enzymy, které byly použity každý zvlášť i v kombinaci, měly na efektivitu transformace negativní účinek. Režim nepřetržitého osvětlení měl pozitivní vliv na frekvenci explantátů s uniformní expresí GUS.

Optimalizované regenerační protokoly jsou předpokladem pro aplikaci biotechnologických metod v programech zlepšujících vlastnosti plodin, včetně selekcí in vitro. Byl zkoumán regenerační potenciál tvorby rostlin de novo prostřednictvím organogeneze a somatické embryogeneze u bobu a lupiny. U bobu bylo dosaženo stádia zakořeňujících prýtů organogenezí z nodálních segmentů, somatická embryogeneze z kalusu byla neúspěšná. U lupiny bylo dosaženo prýtů, ale bez schopnosti zakořenit. U lupiny bylo dosaženo somatické embryogeneze, ale bez dalších vývojových stadií. Mezi druhy Lupinus albus a L.angustifolius byly pozorovány rozdíly v responzivní reakci.

Přehledná přednáška o jednotlivých etapách vývoje GM luskovin od konce 80. let minulého století, ve kterých se postupně řešilo zlepšení agronomických vlastností, zlepšení vlastností důležitých pro spotřebitele a možnosti molekulárního farmingu. Nástin legislativních a politicko-obchodních překážek, trendů a strategií výzkumu v této oblasti. Podrobné informace o konkrétních výsledcích transgenoze u hrachu v rámci řešených projektů ve společnosti Agritec, s.r.o.

Studie je zaměřena na srovnání vybraných odrůd lnu setého (Linum usitatissimum L.) z hlediska tolerance k těžkým kovům (Cd, Pb, Cs, Zn a Cu) ve fázi klíčení. Cílem bylo nalezení inhibiční koncentrace IC 50 u jednotlivých kovových elementů a zároveň nalezení vhodných odrůd (citlivých / tolerantních vůči těžkým kovům) pro následné testování v podmínkách in vitro a in vivo. Růst kořene u klíčících semen byl sledován ve 4-denním laboratorním testu toxicity na koncentrační škále 0 - 0,1 – 1 – 10 - 100 mmol.l-1 příslušného kovového elementu v dusičnanové formě. Vliv těžkých kovů na inhibici růstu kořínku byl lineární a jejich toxicita (v průměru za všechny odrůdy) klesala v pořadí Cd > Cu > Cs > Pb > Zn. Odrůda přadného lnu Venica vykazovala vysokou citlivost vůči všem testovaným kovům, jako relativně tolerantní se jevila odrůda přadného lnu Elektra.

Presentace výsledků analýzy morfologických a molekulárních dat vybraných 180 položek hrachu pomocí 42 morfologických, 10 mirkosatelitních a 27 retrotransposonových markerů. Tyto data byly podrobeny shlukové analýze, analýze genetické vzdálenosti a následně konstruovány dendrogramy příbuznosti.

Kmín (Carum carvi L.) je tradiční miříkovitou léčivou a cizosprašnou rostlinou. Konvenční šlechtitelské metody se soustředěné na vysoký výnos a kvalitu silice v semeni jsou omezeny nízkou genetickou proměnlivostí (Nemeth 1998, Evenhuis et al. 1998). Současná studia rodu Daucaceae nenásledují možnosti dihaploidních rostlin přes in vitro pylovou embryogenezi kromě mrkve (Andersen et al. 1990, Adamus a Michalik 2003). Pro ověření schopnosti tvorby DH rostlin u kmínu bylo testováno 10 vybraných genotypu ozimého kmínu. Stav ploidie z regenerovaný rostlin byl analyzovaný pomocí flow-cytrometrie. Začátek pylového vývoje z normální gametogeneze k sporogenezi byla zjištován metodami světelné a fluorescenční mikroskopie. Donorové, haploidní, dihaploidní, andiploidní rostliny byly srovnávané analýzou esterasáz (EST) pro rozlišení pylového nebo prašníkového původu regenerujících rostlin. Četnost indukce embryogeneze byla nízká. Mikroskopie metoda ukázala asynchronní vývoj pyl uvnitř prašníků.

Vybraný soubor 20 meziliniových F1 hybridů Brassica napus L. bylo hodnoceno z hlediska jejich schopnosti produkovat dihaploidní (DH) rostliny odvozené z mikrospórové kultury následně využitých ve šlechtitelském projektu Česká Řepka. Všechny testované genotypy byly schopny regenerovat embrya z mikrospór podle standardizovaného protokolu, který byl již dříve upraven pro odrůdy/šlechtitelské linie České Řepky; byly zjištěny významné rozdíly v tvorbě embryí mezi jednotlivými genotypy. Fertilní DH regeneranti byly získáni z 12 linií souboru. Ostaních 8 linií v podstatě netvořilo DH rostliny z různých důvodů, zejména v důsledku změněné morfologie mikrosporórových embryí ve spojení s omezenou schopností klíčení/konverze a v důsledku neúspěšného ošetření kolchicinem, které mělo za následek haploidní nebo mixoploidní (chimerické) regeneranty vykazující částečnou nebo úplnou sterilitu.

Na 5 lokalitách ČR by uskutečněn sběr izolátů virových patogenů PEMV a PSbMV (determinace symptomy na rostlinách a ELISA), které byly dále charakterizovány biologickými a molekulárními testy. Izoláty s nejvyšší patogenitou bly vybrány pro sekvenování a vývoj konstruktu pro transformaci hrachu. Strategie indukce rezistence byla založena na pathogen-derived resistance (PDR) a post-transkripčním urišování genů (PTGS). Komerční odrůdy byly transformovány a byly získány T1 rostliny s GUS/PCR pozitivní reakcí. Na těchto rostlinách bude dále studována reakce na virovou infekci.

Postup agrobakteriální genetické transformace vycházející ze trí ruzných regeneracních systému (indukce organogeneze z apikálních meristému, nodálních segmentu a regenerace upravených klícících semen) byl overen u 6 genotypu. Byly odzkoušeny ruzné podmínky kokultivace - vliv sonikace, vakuové infiltrace, chemických aditiv (acetosyringone, azacytidine, glutathione, dithiothreitol, L-cystein) a optimalizovány podmínky pro jednotlivé regneracní systémy. Potenciálne transgenní linie byly testovány histochemicky a analyzovány molekulárne PCR a Southern blot. Prenos transgenu byl overen do generace T3. Metodika je pripravena pro transformace konstrukty nesoucími šlechtitelsky a spotrebitelsky využitelné vlastnosti.

Byla presentována metoda transformace rostlin hrachu setého pomocí agrobakteriální transformace jednak s využitím in vitro a také in vitro protokolů. demonstrovali jsme úspěšnou transformaci s využitím pBIN19 konstruktu obsahujícím T-DNA s reporterovým genem GUS pro histochemickou detekci a selekčním markerem genu NPTII rezistence ke kanamycinu aplůikovaný na 6 genotypech hrachu. byla nalezeny optimální podmínky transformace a integrace transgenu byla prokázána pomocí PCR a Southern blotingu v regenerantech T1 a T3 generace.

Pomocí 42 morfologických a několika molekulárních markerů, 6 SSR, 25 RBIP a 2 IRAP retrotransposonových markerů bylo získáno celkem 51 hodnotitelných znaků, na jejichž základě byly vypočítány genetické vzdálenosti a provedena shluková analýza jednak morfologických tak i DNA dat. Zjištěná genetická struktura poslouží jednak k cílovému získání core kolekce, odstranění duplikací a racionalizaci šlechtění.

Produkce dihaploidního materiálu kmínu ozimého cestou pylové embryogeneze byla testována na 10 vybraných materiálech. Sledovala se rozdílnost reakce genotypu na indukcní podmínky in vitro, Vytvárená metodika prinesla mnoho aspektu, které mají vliv na úspešnost indukce embryí a na jejich další regeneraci v in vivo podmínkách. Flow-cytometrické stanovení ploidie získaných regenerantu poukazuje na vysoké zastoupení haploidních rostlin, které byly kolchicnovány pro produkci fertilního ciste homozygotního materiálu. Dihaploid production of winter type of caraway via pollen embryogenesis were tested on 10 selected breeding materials. differences in response of the genotypes during in vitro induction conditions were observed. Established method show on many factors, which significant effect efficiency of embryos production and their followed regeneration under in vivo conditions. Flow cytometry determination of ploidy level of the obtained regenerated plants shown on high percentage of haploid plant mater

Cd a Pb představují nejčastěji distribuované škodliviny na zemědělsky využívané půdy. Odrůdy přadného a olejného lnu byly hodnoceny ve čtyřletém přírodně simulovaném experimentu (2001-2004) na jejich toleranci, příjem a akumulaci Cd a Pb. Obecně lze říci, že oba typy lnu dobře snášely zvýšené koncentrace těžkých kovů půdy bez dramatických vlivů na růst rostlin a vývoj. Geneticky založené rozdíly (odrůdové rozdíly) byly pozorovány v přejímání a akumulaci Cd a Pb.

Byla provedena klasifikace 34 aktuálně pěstovaných odrůd hrachu registrovaných v České republice pomocí 42 morfologických deskriptorů, 3 isoenzymových biochemických markerů, 8 mikrosatelitních (SSR) a 2 retrotransposonových DNA markerů. Pro práci byly zvoleny takové molekulární metody, které jsou relativně jednoduché, levné a rychlé. Získané výsledky demonstrují možnosti a odlišovací schopnosti metod založených na DNA.

Účinné regenerační systémy patří k nejdůležitějším předpokladům úspěšné genetické transformace. Obecně je většina luskovin považována za obtížně geneticky transformovatelné. V případě hrachu byly pro genetickou transformaci pomocí Agrobacteria využity tři techniky (embryogeneze, organogeneze a in vivo). Plazmid obsahoval reporterový gen uidA a selekční geny nptII nebo bar.

S využitím kontinuální 23leté organogenní in vitro kultury hrachu jsme sledovali její genetickou stabilitu pomocí molekulárních metod.

Byly studovány rizika spojená s pěstováním geneticky modifikovaného hrachu pomocí simulačního eperimentu s dominatními a recesivními znaky a sledována míra možného cizosprášení v následných F1-2 generacích (2001-2003). takto byla stanovena míra rizika přenosu pylu, dále pak byl sledován výskyt a chování jednotlivých druhů hmyzu, jako potencionálních přenosců pylu. během celého epxerimentu nebylo prokázano cizosprášení ( mezi přibližně 40 tisíci jedinci hrachu), což naznačuje velmi nízkou možnost cizosprášení.

Rutinní regenerační protokol pro embryogenní suspenze stále není k dispozici. Takový protokol by znamenal důležitý nástroj pro množení, výběr mutantů a biolostickou transformaci u hrachu. Zde jsou prezentována některá metodologická data ve vztahu k vývoji embryogenních suspenzí u hrachu.

Konopí je tradičně používáno jako vláknitá a energetická plodina s vysokým výnosem biomasy . V posledním desetiletí se objevily první pokusy o využití konopí pro fytoremediační účely, konkrétně pro fytoextrakci těžkých kovů . Přesto, že dostupné informace o genetické varabilitě v akumulaci TK , stejně jako vliv TK na růst rostlin / parametry výnosu a kvality je velmi úlomkovitý a stále ještě není dostatečný pro komerční využití této plodiny pro rozsáhlé půdní fytoextrakce. Zde prezentujeme 3-leté studium (2001-2003) účinků Cd a Pb na růst a akumulaci TK u čtyři odrůd konopí.

Vývoj zygotických embryí hrachu je spojen s působením kyseliny abscisové a akumulací zásobních produktů (škrob, proteiny). Byl studován vztah mezi hladinami kyseliny abscisové a expresí zásobních proteinů u zygotických embryí v průběhu vývoje semene hrachu.

S využitím organogenní kontinuální in vitro kultury hrachu, založené před 21 lety, byla pomocí molekulárních markerů a flow-cytometrie studována genetické stabilita ve srovnání s původním osivem. Byla konstatována stabilita jak na úrovni ploidie, tak rovněž na úrovni retrotransposonových a mikrosatelitních markerů.

Development of GMO associated risk assessment proposal based on model trials with important species and characterisation of individual regions in Czech republicDevelopment of GMO associated risk assessment proposal based on model trials with important species and characterisation of individual regions in Czech republic.

Pšenice, jakožto jedna z nejvýznamnějších světových polních plodin, je rovněž rostlinným druhem u něhož jsou aplikovány postupy moderních biotechnologií včetně metod genetického inženýrství. Pohled na uvolňování GM odrůd musí být nestranný a podložený odpovídajícími vědecky podloženými daty. V rámci přednášky jsou kromě jiných dat diskutovány vědecky podložené údaje o dálkovém přenosu pylu a podílu cizosprášení u pšenice pro potřeby posouzení biologické bezpečnosti a pro návrh pěstebních opatření při uvolňování GM odrůd pšenice v České republice.

Vývoj embryogenních suspenzí je velmi důležitý pro další pokrok při studiu fyziologických i genetických aspektů somatické embryogeneze u Pisum sativum L. Studie ukazuje metodologická data, získaná během vývoje embryogenních suspenzí u hrachu a budoucí strategii pro ustavení embryogenní suspenze či repetitivní somatické embryogeneze v tekutých médiích.